閆林軒 梅霄陽(yáng) 章林明 常越辰 馬克濤 李麗 王勤章 李應(yīng)龍，3

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院（新疆石河子832000）；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（新疆石河子832000）；3成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院（成都610000）

腎臟缺血再灌注損傷（renal ischemia?reperfu? sion injury，RIRI）是泌尿外科臨床工作中常見(jiàn)的病理過(guò)程。RIRI 會(huì)造成腎小管上皮細(xì)胞極性喪失及離子進(jìn)出胞膜功能障礙，細(xì)胞與細(xì)胞以及和細(xì)胞基質(zhì)的粘附能力降低，細(xì)胞凋亡程序的啟動(dòng)，最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞脫落凋亡［1］，嚴(yán)重影響腎功能。腎小管上皮細(xì)胞的凋亡是RIRI 的顯著特征，如何在RIRI 中減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡具有重要的臨床意義。藥物預(yù)處理已成為其損傷預(yù)防和治療的關(guān)鍵切入點(diǎn)［2］。本課題組前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，雌激素可通過(guò)抗凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫平衡及動(dòng)脈舒縮功能等對(duì)RIRI 起到保護(hù)作用［3-6］。如何有效提高雌激素作用的靶向性，避免雌激素的特殊性質(zhì)［7］將成為研究的重點(diǎn)。GPER 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的雌激素的一種G 蛋白耦聯(lián)受體［8］，這類(lèi)受體定位于細(xì)胞膜上，可發(fā)揮雌激素的快速非基因組效應(yīng)［9］。有研究［10-12］表明GPER 可通過(guò)減輕細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮對(duì)心肌、腦、小腸等I/R損傷后的保護(hù)作用。因此，本研究通過(guò)建立OVX 大鼠腎臟I/R損傷模型來(lái)研究GPER 對(duì)RIRI 后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，探討其相關(guān)機(jī)制，為今后臨床治療RIRI 提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料選取SPF 級(jí)雌性Sprague?Dawley（SD）大鼠（10 ～12 周齡，220 ～280 g）32 只，從新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心獲得（許可證編號(hào)SCXK 新2018?0001）。經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理和使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)（A2046?047?02）。購(gòu)進(jìn)SD大鼠后適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，動(dòng)物房控制溫度在24 ～28 ℃和濕度45% ～55%，給予標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，水和食物均可自由獲得。

1.2 主要試劑與儀器GPER 受體特異性激動(dòng)劑G1、特異性阻斷劑G15（ApexBio，美國(guó)），兔抗Bcl?2、Caspase?3 抗體（Abcam，美國(guó)），小鼠抗GAPDH、山羊抗兔/小鼠抗體（北京中杉金橋），全自動(dòng)生化分析儀（瑞士Roche 公司），低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），DYY?6D 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 雌性去卵巢（OVX）模型和I/R模型的制備將雌性SD 大鼠禁食水后腹腔注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，切除雙側(cè)卵巢。自術(shù)后14 d，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4 組，每組8 只。（1）OVX 組；（2）缺血再灌注損傷（OVX+I/R）組；（3）G1 干預(yù)（OVX+I/R+G1）組；（4）G15 阻斷劑（OVX+I/R+G15+G1）組。經(jīng)腹腔注射給予G1 干預(yù)（120 μg/kg·d），連續(xù)3 d；G15 阻斷劑（300 μg/kg·d），30 min 后給予腹腔注射G1 干預(yù)（120 μg/kg·d），連續(xù)3 d；其余兩組給予等量DMSO［13-14］。再次麻醉后切除右腎，分離左腎動(dòng)脈并用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉，觀察腎臟顏色逐漸變?yōu)榘导t色，說(shuō)明缺血成功，45 min 后去除無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾，恢復(fù)腎臟灌流，再灌注24 h。

1.3.2 血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、乳酸脫氫酶（LDH）的檢測(cè)再灌注24 h 后，各組大鼠行腹主動(dòng)脈采全血，低溫高速離心機(jī)4 000 r/min 離心10 min，取上清測(cè)定SCr、BUN、LDH，評(píng)價(jià)各組大鼠腎功能。

1.3.3 HE 染色和Paller 評(píng)分取左腎常規(guī)石蠟包埋，HE 染色，200 倍光鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)的改變。并由兩名專(zhuān)業(yè)的病理科醫(yī)師對(duì)其進(jìn)行Paller 評(píng)分［15］。400 倍鏡下，隨機(jī)選取腎皮髓交界區(qū)10 個(gè)連續(xù)的視野，每高倍鏡視野隨機(jī)選取10 個(gè)腎小管，按100 個(gè)腎小管記分。標(biāo)準(zhǔn)：腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)改變1 分，刷狀緣損傷1 分，刷狀緣脫落2 分，管型2 分，管腔內(nèi)有脫落壞死的細(xì)胞（未成管型或細(xì)胞碎片）1 分，管徑變形增寬明顯1 分［16］。

1.3.4 免疫組化檢測(cè)各組大鼠Bcl?2、Caspase?3 蛋白的表達(dá)制備4 μm 厚石蠟切片，二甲苯、乙醇梯度脫蠟水化，蒸餾水清洗3 次，行抗原修復(fù)后用PBS 漂洗3 次，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，復(fù)溫后加入二抗，DAB 染色，在顯微鏡下觀察。

1.3.5 Western blot 法檢測(cè)腎臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平提取腎臟組織總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度后于SDS?聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫封閉2 h。TBST 漂洗后滴加一抗（抗Bcl?2、Caspase?3 和抗GAPDH 抗體均以1∶1 000稀釋?zhuān)?，搖床上4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜，加入二抗（二抗均以1∶10 000 稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，暗室曝光。測(cè)定蛋白條帶灰度值，以GAPDH 蛋白為內(nèi)參，計(jì)算凋亡相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若服從正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用t′檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎功能檢測(cè)結(jié)果與OVX 組相比，OVX+I/R組的SCr、BUN 和LDH 水平顯著升高（P＜0.01）。G1 干預(yù)組較OVX+I/R 組明顯降低（P＜0.01）。G15阻斷劑組均高于G1 干預(yù)組（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2 腎組織HE 染色及Paller 評(píng)分HE 染色200倍光鏡下觀察，與OVX 組相比，OVX+I/R 組腎小管顯著擴(kuò)張其形態(tài)也發(fā)生改變，部分腎小管結(jié)構(gòu)不清，上皮細(xì)胞水腫且核脫落明顯，有管腔阻塞及管型的出現(xiàn)，刷狀緣損傷脫落。G1干預(yù)后可見(jiàn)腎小管輕度擴(kuò)張，細(xì)胞形態(tài)較I/R 組壞死脫落減少。G15阻斷劑組逆轉(zhuǎn)了G1 激動(dòng)GPER 后的保護(hù)作用。Paller 評(píng)分顯示與OVX 組相比，OVX+I/R 組腎小管結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重［（44.38 ± 3.46）vs.（9.63 ± 2.33），P＜0.01］，G1干預(yù)組比OVX+I/R組腎小管損害明顯減輕［（30.38±3.67）vs.（44.38±3.46），P＜0.01］，阻斷劑組可部分逆轉(zhuǎn)G1 激活GPER 后的作用［（38.00±3.21）vs.（30.38±3.67），P＜0.01］。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠SCr（A），BUN（B）和LDH（C）的水平Fig.1 The levels of SCr（A），BUN（B）and LDH（C）in rats from each group

2.3 Bcl?2、Caspase?3 蛋白在大鼠腎臟上的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示Bcl?2 蛋白主要分布于腎小管上皮細(xì)胞胞膜上，胞漿內(nèi)有少量分布，陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色。Caspase?3 蛋白表達(dá)主要分布于腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)，陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色，與OVX 組相比，OVX+I/R 組Bcl?2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)減少，而Cas?pase?3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增加；G1 干預(yù)組較OVX+I/R 組Bcl?2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，Caspase?3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)減少；同時(shí)阻斷劑能夠逆轉(zhuǎn)這種狀況。見(jiàn)圖3。

2.4 凋亡相關(guān)蛋白Bcl?2、Cleaved Caspase?3 的表達(dá)比較OVX+I/R 組與OVX 組相比Bcl?2 蛋白的表達(dá)量降低（P＜0.01），Cleaved Caspase?3 蛋白表達(dá)量則明顯升高（P＜0.01）。G1 干預(yù)組較OVX+I/R 組Bcl?2 蛋白的表達(dá)量升高（P＜0.01），Cleaved Caspase?3 蛋白表達(dá)量降低（P＜0.01）。G15 阻斷劑組可部分逆轉(zhuǎn)G1 的干預(yù)作用（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

3 討論

RIRI 后會(huì)導(dǎo)致SCr、BUN 水平升高，甚至可造成急性腎小管壞死而發(fā)生腎小球?yàn)V過(guò)率急劇下降［17］，最終導(dǎo)致腎功能障礙。本研究首先構(gòu)建雌性SD 大鼠去卵巢模型，去卵巢兩周后雌激素水平明顯降低［18］，排除內(nèi)源性雌激素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響；構(gòu)建I/R 損傷模型來(lái)觀察GPER 在腎臟缺血再灌注損傷中產(chǎn)生的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX+I/R 組大鼠SCr、BUN 及LDH 水平顯著升高，這都提示腎功能有明顯損害。Paller 評(píng)分升高，腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯，提示大鼠出現(xiàn)明顯的腎組織損害，與既往研究一致［13，18-19］。G1 激活GPER 后，腎功能及腎組織損害均減輕，Bcl?2 蛋白的表達(dá)量上升，而Caspase?3蛋白表達(dá)量均下降。

圖2 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變（HE 染色，×200）和Paller 評(píng)分Fig.2 Histopathological changes（HE staining，×200）and Paller score of rats in each group

圖3 免疫組化法檢測(cè)各組大鼠腎組織Bcl?2 與Caspase?3 的表達(dá)（DAB，×200）Fig.3 The expression of Bcl?2 and Caspase?3 in kidney tissues of rats in each group was detected by immunohistochemistry（DAB，×200）

圖4 各組大鼠腎組織Bcl?2 與Cleaved Caspase?3 蛋白表達(dá)的比較Fig.4 Comparison of Bcl?2 and Cleaved Caspase?3 protein expression in kidney tissue of rats in each group

RIRI 后細(xì)胞由于炎癥、氧化應(yīng)激、胞內(nèi)鈣的超載、NO 損傷、興奮毒性等諸多因素［20］，最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而腎小管上皮細(xì)胞凋亡是急性腎損傷的重要機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，于腎臟缺血再灌注前連續(xù)3 d 給予GPER 激動(dòng)劑G1干預(yù)，與OVX+I/R 組相比能夠明顯降低SCr、BUN及LDH 水平，改善了腎臟功能。腎臟HE 染色及Paller 評(píng)分結(jié)果顯示，G1 激活GPER 后腎小管損傷減輕，腎小管上皮細(xì)胞核脫落減少，腎小管管型形成減少，Paller 評(píng)分降低，減輕OVX 大鼠腎臟組織損傷。且CHANG 等［13］研究顯示G1 激活GPER 后可減輕OVX 大鼠腎臟I/R 后的損傷，與本研究結(jié)果相一致。這提示GPER 可減少腎臟缺血再灌注損傷后大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。

GPER 的保護(hù)機(jī)制與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平密切相關(guān)。RIRI 后腎小管上皮細(xì)胞凋亡是由多種凋亡相關(guān)基因參與的調(diào)控過(guò)程。在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Bcl?2 蛋白［21］起重要作用，它是線粒體凋亡通路中的一種抗凋亡蛋白，它可以抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF），維持BAX/BAK 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，阻止二聚化反應(yīng)以及維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)等作用。細(xì)胞凋亡主要有三條途徑：死亡受體途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑［22］。三條凋亡途徑的最后通路都將經(jīng)歷Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生以及Caspase?3 蛋白的表達(dá)，Caspase?3作為核心關(guān)鍵酶參與細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，活化的Cleaved Caspase?3 的水解活性作用可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能損傷DNA 加速細(xì)胞凋亡［23］。從免疫組化和Western blot 結(jié)果看，與OVX+I/R 組相比，在G1 激動(dòng)GPER 后能夠明顯增加腎臟組織及腎小管上皮細(xì)胞中Bcl?2 蛋白表達(dá)，減少由I/R 損傷引起的Caspase?3 蛋白的表達(dá)。這提示腎臟I/R 損傷可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡，而GPER 可以通過(guò)增加Bcl?2 蛋白的表達(dá)，抑制Caspase?3 蛋白的表達(dá)來(lái)減輕細(xì)胞凋亡，與以往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類(lèi)似［24］。結(jié)合上文結(jié)果來(lái)看，GPER 發(fā)揮腎臟I/R 損傷的保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制凋亡通路的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實(shí)了GPER 可以通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡減輕RIRI 后的腎損傷，進(jìn)一步驗(yàn)證了G1 激活GPER 后對(duì)RIRI 的保護(hù)作用，為臨床治療RIRI 提供了新思路。但GPER 通過(guò)調(diào)控何種信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡尚不明確，其相關(guān)的分子機(jī)制還需要課題組進(jìn)一步研究。