陳佳琳 林翠燕 賴美燕 林健如 張慧 過新民

暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科（廣州510220）

超聲靶向微泡破壞（UTMD）是一種具有無創(chuàng)性介導(dǎo)基因定位釋放的新型基因遞送技術(shù)，可作為當(dāng)前基因治療的有效方法之一。肝細(xì)胞性肝癌（HCC）在腫瘤中發(fā)病率位居第六位，是全球第四大癌癥死亡原因，目前治療方法逐步多樣化及綜合化，基因治療是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［1-2］。近年來發(fā)現(xiàn)microRNA 等小分子可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白，如CDK1、CDK2、cyclinD1 等影響HCC 的細(xì)胞增殖、周期等生物學(xué)特性［3］。Caprin?1 是一種廣泛表達(dá)的RNA 結(jié)合蛋白，不僅能通過控制相關(guān)基因的調(diào)節(jié)來影響細(xì)胞周期，其聚合物也可參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，具有成為生物標(biāo)志物和治療新靶標(biāo)的潛力［4-5］。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道Caprin?1 與HCC 的發(fā)生、預(yù)后及術(shù)后早期復(fù)發(fā)具有一定的相關(guān)性［6］，但Caprin?1 對HCC 的作用及機(jī)理研究均較少。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建并篩選Caprin?1 敲除質(zhì)粒、觀察超聲微泡介導(dǎo)其轉(zhuǎn)染對人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖、周期及cyclinD1 及cyclinD2 表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究Caprin?1 表達(dá)異常在肝癌發(fā)病機(jī)理中的作用提供思路，為肝癌的靶向治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑pX330質(zhì)粒載體系統(tǒng)（CRIS?PR/Cas 系統(tǒng)）（輝園苑公司，貨號：#HYY2001）、HepG2 人肝癌細(xì)胞（廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司）、Bsmb1 內(nèi)切酶（NEB 貨號：#R0580S）、T4 DNA連接酶（Thermo，貨號：EL0011）、Trans5a 感受態(tài)細(xì)胞（Transgene，貨號：CD201?02）、Anti?CAPRIN1抗體（abcam，貨號ab38859）、β?Actin 抗體（博士德，貨號BM0627）、兔抗羊IgG?HRP（博士德，貨號BA1060）、GAPDH 抗體（Proteintech，貨號10494?1?AP）、羊抗兔IgG?HRP（博士德，貨號BA1054）、羊抗小鼠IgG?HRP（博士德，貨號BA1050）、RNA pure總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）（BIOTEKE，貨號：RP1201）、注射用六氟化硫微泡（聲諾維，Bracco Suisse SA，國藥準(zhǔn)字J20130045）、CCK?8 試劑盒（BEYOTIME）、東芝超聲診斷儀（Apilo 500）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Caprin?1 敲除載體構(gòu)建設(shè)計(jì)測序引物JDsgRNA?R、Caprin?1敲除質(zhì)粒KO?1及KO?2引物序列（表1），CRISPR/Cas載體用內(nèi)切酶Bsmb1酶切，將KO?1 及KO?2 引物序列通過連接酶與酶切位點(diǎn)結(jié)合，采用Trans5a 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，篩選陽性菌株并通過引物JDsgRNA?R 測序鑒定，按試劑盒要求提取、純化質(zhì)粒，跑膠鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組（1）NC 組：微泡濃度（5%）+空載質(zhì)粒（2 μg）+無血清培養(yǎng)基（DMEM）；（2）實(shí)驗(yàn)組1：微泡濃度（5%）+Caprin?1?KO?1（2 μg）+無血清培養(yǎng)基（DMEM）；（3）實(shí)驗(yàn)組2：微泡濃度（5%）+Caprin?1?KO?2（2 μg）+無血清培養(yǎng)基（DMEM）。

1.2.3 超聲輻照轉(zhuǎn)染采用課題組前期實(shí)驗(yàn)成果，設(shè)置最佳轉(zhuǎn)染條件（頻率2.0 MHz，MI：0.37，時(shí)間：20 s）［7］，將適量耦合劑置于超聲診斷儀的探頭上后置于培養(yǎng)板底部，對三組細(xì)胞分別進(jìn)行輻照處理，之后在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.4 Western blot 檢測Caprin?1 蛋白的表達(dá)和篩選最優(yōu)質(zhì)粒將收集三個(gè)組的細(xì)胞分別加入細(xì)胞裂解液。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜中并封閉膜。與一抗Caprin?1 和GAPDH 孵育，在4 ℃搖床過夜后，用TBST 洗膜，在室溫下再用二抗孵育1 h，繼續(xù)洗膜，ECL 化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯示、定影。用IPP6.0 軟件分析蛋白質(zhì)條帶的IOD 值。

1.2.5 CCK?8 法檢測細(xì)胞增殖取經(jīng)轉(zhuǎn)染后的對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以200 μL/孔接種在96 孔板中，并做好標(biāo)記，各組重復(fù)三次。放入培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中預(yù)培養(yǎng)。將20 μL/孔CCK?8 溶液加入到各組中，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，待4 h 后使用酶標(biāo)儀測定在波長為450 nm 處的吸光度值（OD值）。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48 及72 h 時(shí)測定吸光度。

1.2.6 FCM 檢測細(xì)胞周期取經(jīng)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)的HEPG2?KO?CAPRIN1 組及HEPG2?KO?NC 組細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，PBS 清洗細(xì)胞2 次。加入70%預(yù)冷乙醇中使細(xì)胞重懸，吹散后于4℃固定1 ～2 h。繼續(xù)離心，用PBS 清洗細(xì)胞1 次，加入500 μL PBS，避光在4℃下孵育30 min。用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 qPCR 法測定細(xì)胞中cyclinD1和cyclinD2的表達(dá)量取經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的實(shí)驗(yàn)組（HEPG2?KO?CAPRIN1）及對照組細(xì)胞（HEPG2?KO?NC），按試劑盒要求，先利用RNA pure 快速提取試劑盒提取總RNA、再對總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后按照qPCR 試劑盒說明進(jìn)行qPCR 反應(yīng)并跑膠驗(yàn)證，基因相對表達(dá)變化量采用2?△△CT（Livak）方法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)為計(jì)量資料時(shí)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本比較用t檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Caprin?1?KO 構(gòu)建結(jié)果質(zhì)粒Caprin?1?KO?1與Caprin?1?KO?2 的結(jié)構(gòu)圖譜分別見圖1、2。選取0.5 μg 質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定質(zhì)粒質(zhì)量，結(jié)果見圖3、4，條帶大小符合預(yù)期。進(jìn)一步將構(gòu)建的質(zhì)粒送公司測序，圖5、6 所示測定序列與原設(shè)計(jì)相符，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Caprin?1?KO?1 的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜Fig.1 Plasmid structure map of Caprin?1?KO?1

圖2 Caprin?1?KO?2 的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜Fig.2 Plasmid structure map of Caprin?1?KO?2

圖3 Caprin?1?KO?1 質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定結(jié)果Fig.3 The result of restriction digestion of Caprin?1?KO?1 plasmid

圖4 Caprin?1?KO?2 質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定結(jié)果Fig.4 The result of restriction digestion of Caprin?1?KO?2 plasmid

圖5 Caprin?1?KO?1 質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of Caprin?1?KO?1 plasmid

圖6 Caprin?1?KO?2 質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.6 Sequencing results of Caprin?1?KO?2 plasmid

2.2 Western blot 法鑒定轉(zhuǎn)染后HepG2 細(xì)胞中Caprin?1 的IOD 值根據(jù)圖7、8 結(jié)果示，與NC 組及KO?1 組相比，KO?2 組轉(zhuǎn)染后Caprin?1 相對表達(dá)量IOD 值明顯最低（P ＜0.05）。這表明用于后續(xù)細(xì)胞學(xué)研究的最優(yōu)質(zhì)粒為KO?2 組（稍后命名為Caprin?1?KO）。

圖7 不同質(zhì)粒Caprin?1 蛋白鑒定結(jié)果Fig.7 Caprin?1 protein identification results of different plasmids

圖8 不同質(zhì)粒在最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下Caprin?1 蛋白的相對表達(dá)量Fig.8 The relative expression of Caprin?1 protein of different plasmids under optimal transfection conditions

2.3 CCK?8 法檢測Caprin?1?KO 表達(dá)對HepG2細(xì)胞增殖抑制的影響見圖9，在4 h 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)在24、48 和72 h 時(shí)，HEPG2?KO?NC 組細(xì)胞OD值明顯高于HEPG2?KO?CAPRIN1 組，且隨著時(shí)間的推移，OD值的差異增大（P＜0.05），這表明Caprin?1 為HepG2 細(xì)胞的促癌基因，Caprin?1?KO被轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞活性減弱，可抑制細(xì)胞增殖。

圖9 不同時(shí)間培養(yǎng)人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖的OD 值情況Fig.9 The OD value of the proliferation of human liver cancer HepG2 cells cultured at different times

2.4 FCM檢測Caprin?1?KO表達(dá)對細(xì)胞周期阻滯的影響見圖10、11，細(xì)胞周期各期均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在G0/G1 期，HEPG2?KO?CAPRIN1 組的HepG2細(xì)胞數(shù)量較HEPG2?KO?NC 組明顯增多，S 期及G2/M 期數(shù)量則明顯下降。這說明Caprin?1?KO 可使人肝癌HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1 期。

圖10 抑制Caprin?1 表達(dá)后對人肝癌HepG2 細(xì)胞周期影響結(jié)果Fig.10 The result of inhibiting Caprin?1 expression on the cell cycle of human liver cancer HepG2

2.5 qPCR 法檢測Caprin?1 對細(xì)胞cyclinD1 和cy?clinD2 的表達(dá)量的影響見圖12，在HEPG2?KO?CARPIN1 組中細(xì)胞的cyclinD1 和cyclinD2 均表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明Cap?rin?1 敲除后細(xì)胞周期受到阻滯，抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

3 討論

圖11 兩組周期結(jié)果圖Fig.11 Cell cycle result of the two group

目前，對肝細(xì)胞性肝癌（HCC）治療的研究已經(jīng)到達(dá)分子生物學(xué)水平，該治療方式對早期診斷無癥狀的HCC、預(yù)測肝癌患者手術(shù)治療后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的能力，從而改善患者的預(yù)后十分重要［8-9］。分子生物標(biāo)志物如高爾基體蛋白73（GP73），磷脂酰肌醇聚糖3（GPC?3），甲胎蛋白異質(zhì)體3（AFP?L3）等［11-12］，與傳統(tǒng)的臨床病理學(xué)指標(biāo)相比具有更強(qiáng)的預(yù)測能力［10］。但對于晚期患者來說其臨床應(yīng)用效果仍然不理想。因此，發(fā)現(xiàn)HCC 的新預(yù)后生物標(biāo)志物仍然很重要，有利于患者的治療和改善患者預(yù)后。

圖12 HEPG2?KO?CAPRIN1 細(xì)胞中cyclinD1，cyclinD2 的表達(dá)量Fig.12 The expression levels of cyclinD1 and cyclinD2 in HEPG2?KO?CAPRIN1 cells

Caprin?1 是脊椎動(dòng)物中普遍表達(dá)、高度保守的細(xì)胞質(zhì)磷蛋白，由709 個(gè)氨基酸組成，含有RNA 結(jié)合蛋白特有的RGG 序列［4］。其與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，缺乏Caprin?1 可能會阻滯細(xì)胞周期內(nèi)G1 期至S期的進(jìn)展［13］。Caprin?1 與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，在不同的腫瘤細(xì)胞中，Caprin?1 及其相關(guān)蛋白可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑影響疾病進(jìn)展。Caprin?1 在乳腺癌細(xì)胞中是miR?223的靶標(biāo)，通過調(diào)控Caprin?1 miRNA 的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）抑制癌細(xì)胞的增殖及侵襲［14］。Caprin?1 在骨肉瘤細(xì)胞中可通過激活ERK1/2 及Akt 通路參與細(xì)胞增殖，凋亡和轉(zhuǎn)移［15］。在結(jié)腸癌中，miR?193a 高表達(dá)可抑制Caprin?1/G3BP?1/c?MYC/Cyclin D2 表達(dá)，并可引起細(xì)胞周期G1 期停滯從而使細(xì)胞增殖受到抑制，表明Caprin?1可能對結(jié)腸癌的診療有潛在的應(yīng)用價(jià)值［16］。在HCC中，TAN等［17］發(fā)現(xiàn)Caprin?1高表達(dá)與HCC 總生存率存在顯著負(fù)相關(guān)，可獨(dú)立預(yù)測HCC 患者的預(yù)后，這表明Caprin?1可能與與HCC疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。在本研究中，通過UTMD 法將構(gòu)建的質(zhì)粒Caprin?1?KO 轉(zhuǎn)染入人肝癌HepG2 細(xì)胞，用于抑制培養(yǎng)細(xì)胞中Caprin?1 的表達(dá)。研究結(jié)果表明，抑制Caprin?1 表達(dá)后，cyclinD1 和cyclinD2 均表達(dá)下調(diào)，cyclinD1 和cyclinD2 為細(xì)胞周期蛋白家族的成員，參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)，以使G1 轉(zhuǎn)變?yōu)镾 期［18］，與細(xì)胞生長密切相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制Caprin?1 表達(dá)后，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞周期阻滯細(xì)胞在G0/G1 期。細(xì)胞周期的有序進(jìn)行依賴于細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白的質(zhì)量控制，G1?S 檢查點(diǎn)決定細(xì)胞的增殖，當(dāng)細(xì)胞周期受到阻滯時(shí)，說明了DNA 出現(xiàn)了損傷，阻滯是為了給細(xì)胞提供修復(fù)損傷的時(shí)間，從而減少突變，避免腫瘤發(fā)生［19］。本研究并未進(jìn)一步探索Caprin?1 與cyclinD1、cy?clinD2 的相互關(guān)系，Caprin?1 作用于cyclinD1/D2 mRNA 是否可激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)調(diào)節(jié)通路來影響細(xì)胞增殖有待進(jìn)一步探索。

綜上，Caprin?1 為HCC 的促癌基因，超聲微泡介導(dǎo)Caprin?1 敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2 細(xì)胞，cyclinD1 和cyclinD2 表達(dá)下降，細(xì)胞增殖受到抑制，周期發(fā)生阻滯，表明Caprin?1 可能通過調(diào)節(jié)cy?clinD1 和cyclinD2 的表達(dá)對細(xì)胞增殖、周期產(chǎn)生影響，從而與HCC 疾病的進(jìn)展相聯(lián)系，這為進(jìn)一步研究Caprin?1 表達(dá)在肝癌發(fā)病機(jī)理中的作用提供思路。