印媛君 郭燚 唐比強 毛穩(wěn) 趙娜 杜月光

浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053

糖尿病腎臟疾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最主要的進行性微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎病的原因之一，其病理特點包括腎小球硬化、腎小管萎縮、腎小管間質纖維化等。研究發(fā)現(xiàn)，DKD的早期即出現(xiàn)腎小管損傷，并引起腎小球的病變，而腎小管-間質病變與腎臟損傷的關系更加緊密[1]。

腎小管是葡萄糖重吸收的主要場所。血糖升高時，腎小管線粒體內的氧化磷酸化反應明顯增強，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的大量產生可引起腎小管上皮細胞損傷和間質纖維化[2]。線粒體自噬（mitophagy）是一種選擇性自噬，可以特異性選擇并清除受損或老化的線粒體，減少細胞內的ROS，從而維持機體自身穩(wěn)態(tài)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬的缺陷與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。

沉默信息調節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）和SIRT3為Sirtuins家族成員，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）依賴的組蛋白去乙?；富钚?，參與細胞衰老、抗氧化應激和能量代謝等多種細胞功能活動的調節(jié)，與衰老相關性疾病、代謝性疾病等密切相關[5]。研究表明，SIRT1可調節(jié)多種與線粒體增殖和自噬相關的轉錄因子表達及活性，對線粒體質量和數(shù)量的調節(jié)起著重要的作用[6]。SIRT3主要定位于線粒體，是主要的蛋白去乙酰化酶，通過調節(jié)線粒體內關鍵蛋白的乙?；癄顟B(tài)與活性來維持線粒體的正常生理功能[5]?；赟IRT1和SIRT3在線粒體結構和功能調節(jié)中的作用，筆者推測兩者有一定的聯(lián)系。因此，本研究通過腺病毒轉染使Zucker糖尿病肥胖（Zucker diabetic fatty，ZDF）大鼠發(fā)生SIRT1過表達，觀察其對線粒體自噬的影響以及SIRT3表達的影響，以進一步闡明SIRT1、SIRT3在DKD中的作用以及SIRT1與SIRT3的關系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性ZDF大鼠16只，8周齡，體質量（265±10）g；清潔級雄性ZL大鼠8只，8周齡，體質量（180±10）g，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［實驗動物生產許可證號碼：SCXK（京）2016-0006］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，［實驗動物使用許可證號碼：SYXK （浙）2018-0012］。大鼠自由飲水和進食，12h交替照明。

1.1.2 試劑與儀器 高脂高糖飼料（配方：50%基礎飼料、15%蔗糖、15%蛋黃粉、10%全脂奶粉、10%豬油）購自南通特洛菲飼料科技有限公司（批號：pumina#5008）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、p62抗體、SIRT3抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購于英國Abcam公司（批號：ab21027、ab56416、ab118334、ab181602）；SIRT1抗體購于 英國Biorbyt公司（批號：orb19330）；微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）抗體購于美國CST公司（批號：CST4108）；山羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗和山羊抗兔IgG二抗均購于美國Thermo Pierce公司（批號：31160、31210）； 實時定量聚合酶鏈式反應 （Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR） 試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司 （批號：CW0957M）；逆轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購于寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司（批號：RR047A）。7020型全自動生化分析儀為日本日立公司產品；Thermo多功能酶標儀購于美國Varioskan Flash Thermo公司；LightCycler480型PCR儀購于瑞士羅氏公司；S1000 Thermal Cycler、Mini-Protein電泳系統(tǒng)及Mini Trans-Blot轉印系統(tǒng)均購于美國Bio-Rad公司；紫外分光光度計為美國Beckman公司產品；低溫高速離心機購于德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 ZDF大鼠適應性喂養(yǎng)1周后改為高脂高糖飼料喂養(yǎng)，4周后尾部取血檢測空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），以FBG≥7.8mmol·L-1為建模成功。根據(jù)血糖值將大鼠隨機分為模型組、SIRT1過表達組，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)10周；將8只ZL大鼠設為正常組，以普通飼料喂養(yǎng)10周。SIRT1過表達組大鼠于實驗第1天尾靜脈注射重組腺病毒-SIRT1（adenovirussirt1，Ad-SIRT1），1周后再次注射重組Ad-SIRT1。

1.2.2 標本收集 實驗結束前1d收集大鼠24h尿液，用于測定尿蛋白（urinary protein，UP）和尿微量蛋白（urinary albumin，U-ALB）水平。 各組大鼠禁食8h后，以10%水合氯醛按照3.5mg·kg-1的劑量進行腹腔注射麻醉，心臟采血，4℃下4 000r/min離心10min，收集血清，用于檢測生化指標。分離大鼠腎臟，去包膜，對切，部分腎組織以10%中性甲醛溶液固定，用于病理檢測；其余部分行快速液氮冷凍，-80℃保存，用于蛋白及mRNA表達檢測。

1.2.3 生化指標檢測 采用全自動生化分析儀檢測FBG、UP、U-ALB和血肌酐（serum creatinine，Scr）水平。

1.2.4 腎組織病理觀察與分析 取一側腎臟，去除包膜，10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和Masson染色，光鏡下觀察腎臟病變和纖維化程度，每張切片觀察20個視野。腎小管-間質損傷（tubuloint-erstitial injury，TI）程度評分參考文獻[7]：TI0：正常腎小管與腎間質；TI1：動脈周圍纖維化；TI2：腎小管周圍纖維化；TI3：透明管型伴局灶纖維化；TI4：局灶纖維化伴大范圍成纖維細胞浸潤。損傷程度分數(shù)根據(jù)以下公式計算：損傷分數(shù)（分）=（0×TI0數(shù)量+1×TI1數(shù)量+2×TI2數(shù)量+3×TI3數(shù)量+4×TI4數(shù)量）/（TI0+TI1+TI2+TI3+TI4）總數(shù)。

1.2.5 Real-time PCR檢測腎組織SIRT1和SIRT3 mRNA表達 采用Trizol提取腎組織總RNA，測定并計算RNA的純度和濃度，再將RNA逆轉錄合成cDNA；用SYBR Green嵌合熒光法進行RT-PCR擴增。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。見表1。反應條件：95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火延伸1min，共40個循環(huán)。每個樣本設置3個復孔，取其循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）均值，計算各組的△Ct（△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因），以2-△△Ct表示基因的相對表達量（△△Ct=各實驗組△Ct值-正常組△Ct值）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 Western blot檢測腎組織蛋白表達 取大鼠腎臟標本剪碎，加入適量裂解液，提取總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchnininc acid，BCA）法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以含5%脫脂奶粉的Tris-鹽酸緩沖液（hydrochloric acid buffer solution，T-TBS） 室溫封閉1h，分別加入一抗（SIRT1稀釋比例為1∶200、SIRT3為1∶500、p62為1∶200、LC3為1∶1 000、Parkin為1∶1 000、GAPDH為1∶10 000），4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（稀釋比例為1∶5 000） 室溫孵育2h，T-TBS洗膜后發(fā)光顯影，以Image J軟件分析條帶的光密度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/內參蛋白光密度值×10。

1.2.7 免疫組化檢測腎組織內α-SMA表達 使用免疫組織化學Envision二步法。腎組織經10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，切片常規(guī)脫蠟、水化、煮沸修復抗原，以3% H2O2封閉內源性過氧化酶，滴加一抗（工作濃度為1:100），濕盒中4℃孵育過夜，磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗后滴加Envision工作液，室溫孵育30min，PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，水洗后樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 正常組大鼠實驗期間一般情況無異常。與正常組比較，實驗后期模型組大鼠體型明顯肥胖，被毛干枯無光澤，脫毛嚴重，活動量明顯減少，伴多尿；SIRT1過表達組一般情況較模型組有所改善。

2.2 各組大鼠生化指標比較 與正常組比較，模型組大鼠FBG、UP、U-ALB和Scr水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，SIRT1過表達組FBG水平明顯降低 （P＜0.01），Scr和U-ALB水平降低，差異都有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；UP水平有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 各組大鼠生化指標比較Tab.2 Comparison of biochemical indexes in each group

2.3 各組大鼠腎組織病理形態(tài)改變 HE染色和Masson染色結果顯示正常組腎小球和腎小管結構正常。模型組腎小球基底膜和系膜區(qū)局灶性基質增生；腎小管-間質呈局灶性病變：腎小管萎縮，出現(xiàn)管型，部分腎小管擴張，間質炎細胞浸潤、纖維增生。SIRT1過表達組腎小球、腎小管-間質病變程度明顯減輕。見圖1、2。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)改變（HE染色，400×）Fig.1 Morphological changes of renal tissues in each group（HE staining，400×）

圖2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)改變（Masson染色，400×）Fig.2 Morphological changes of renal tissues in each group（Masson staining，400×）

TI評分提示，與正常組比較，模型組腎小管及間質損傷程度明顯加重，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，SIRT1過表達組腎小管及間質損傷程度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠TI評分比較Fig.3 Comparison of the TI scores in each group

2.4 各組大鼠腎組織α-SMA的表達 正常組腎組織血管平滑肌可見有α-SMA表達；模型組腎組織除了血管平滑肌有α-SMA的表達外，間質內可見較多的α-SMA表達陽性的細胞；SIRT1過表達組腎組織間質內α-SMA表達陽性細胞較少。見圖4。與正常組比較，模型組腎間質α-SMA陽性細胞數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，SIRT1過表達組腎間質α-SMA陽性細胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 見圖5。

圖4 各組大鼠腎組織α-SMA蛋白表達（400×）Fig.4 Expression of α-SMA in renal tissues in each group（400×）

圖5 各組大鼠腎組織中α-SMA陽性細胞數(shù)比較Fig.5 Comparison of the number of α-SMA positive cells in renal tissues in each group

2.5 各組大鼠腎組織中SIRT1和SIRT3 mRNA表達比較與正常組比較，模型組SIRT1和SIRT3mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；與模型組比較，SIRT1過表達組SIRT1和SIRT3 mRNA表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。 見圖6。

圖6 各組大鼠腎組織中SIRT1和SIRT3 mRNA表達比較Fig.6 Comparison of SIRT1 and SIRT3 mRNA expression in renal tissues in each group

2.6 各組大鼠腎組織SIRT1、SIRT3、LC3、p62和Parkin蛋白表達比較 與正常組比較，模型組SIRT1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、Parkin蛋白表達明顯降低（P＜0.01），p62表達升高（P＜0.05）；SIRT3有一定程度降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 與模型組比較，SIRT1過表達組SIRT1、LC3 Ⅱ/Ⅰ和Parkin表達明顯升高（P＜0.01），SIRT3表達升高（P＜0.05），p62表達明顯降低（P＜0.01）。見圖7、8。

圖7 各組大鼠腎組織中SIRT1、SIRT3蛋白表達比較Fig.7 Comparison of SIRT1，SIRT3 protein expression in renal tissues in each group

圖8 各組大鼠腎組織中p62、LC3和Parkin蛋白表達比較Fig.8 Comparison of p62，LC3 and Parkin protein expression in renal tissues in each group

3 討論

DKD是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，而且是引起終末期腎疾病的原因之一。腎小球結構和功能的改變一直被認為是DKD發(fā)生及發(fā)展的關鍵，但近幾年的研究提示，腎小管病變是DKD早期和原始的病理改變；相當部分糖尿病患者存在腎小管和間質細胞的萎縮，而腎小球正常[1]。本研究選用ZDF大鼠建立2型糖尿病模型，它是一種具有自發(fā)糖尿病傾向的大鼠品系，研究發(fā)現(xiàn)高脂高糖飼料喂養(yǎng)10周后,ZDF大鼠除出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗、高血糖等符合2型糖尿病的癥狀外，還出現(xiàn)了U-ALB和Scr明顯升高等腎功能障礙的表現(xiàn)，病理學觀察顯示局部腎小管萎縮，出現(xiàn)管型，部分腎小管擴張，間質炎性細胞浸潤、纖維增生，而腎小球病變較輕，提示DKD早期即存在TI。

腎固有細胞尤其是腎小管上皮細胞富含線粒體，線粒體功能正常與否直接影響腎小管上皮細胞的功能。糖尿病導致的腎損傷中，腎小管上皮細胞存在以下病理表現(xiàn)：凋亡、萎縮、上皮間質轉化等。研究證實，糖尿病狀態(tài)下血糖升高，腎小管上皮細胞線粒體內的氧化磷酸化反應明顯增強，產生大量ROS，損傷細胞核DNA以及線粒體DNA；同時激活諸多與氧化應激、凋亡、纖維化以及炎癥等相關的信號通路，導致腎小管上皮細胞損傷和間質纖維化[2]。

線粒體自噬是細胞維持線粒體穩(wěn)態(tài)和功能的關鍵調控機制。PTEN誘導的激酶1（PTEN induced kinase 1，PINK1）/Parkin途徑是調控線粒體自噬的經典模式，PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，Parkin為一種E3泛素連接酶。當線粒體損傷時，PINK1聚集于線粒體外膜并激活，進而促使Parkin發(fā)生磷酸化，并由細胞質轉位到線粒體，在線粒體外膜聚集并促進泛素鏈生成，導致線粒體電壓依賴性陰離子通道發(fā)生泛素化。發(fā)生泛素化的線粒體被自噬調節(jié)蛋白p62識別，隨之p62與LC-3Ⅱ結合，使損傷的線粒體被自噬體吞噬，并被溶酶體降解[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬異常與糖尿病腎損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關。糖尿病早期，機體可以通過增強線粒體自噬，清除受損線粒體以維持腎功能穩(wěn)定[8-9]。但持續(xù)高糖狀態(tài)下，線粒體自噬能力下降，細胞中ROS大量產生，加快線粒體片段化以及細胞凋亡進程[10-11]。本研究結果顯示，Parkin蛋白以及LC3-Ⅱ/Ⅰ在模型組大鼠腎組織內表達顯著降低，p62蛋白上調；免疫組化結果顯示間質內α-SMA陽性細胞明顯增加，進一步證實了DKD腎組織中存在線粒體自噬的下降，并出現(xiàn)腎小管上皮向間質的轉化。

SIRT1和SIRT3均為sirtuin家族成員，在調控細胞代謝、凋亡及細胞壽命方面起著重要的作用。研究證實，SIRT1激活可通過抑制炎癥、氧化應激、腎纖維化、細胞凋亡等途徑激活自噬，從而起到改善DKD的作用[12]。前期研究也表明，SIRT1能夠通過抑制炎癥及氧化應激，對糖尿病大鼠腎臟以及高糖誘導的腎固有細胞具有保護作用[13-14]。本研究通過轉染使ZDF大鼠SIRT1過表達，結果顯示腎損傷程度明顯減輕；Parkin蛋白以及LC3-Ⅱ/Ⅰ表達明顯升高，p62蛋白下調，更直接地證實了SIRT1對糖尿病腎損傷的保護作用。

SIRT3存在于線粒體中，其主要功能是對線粒體的結構和功能進行調節(jié)[5]。研究證實，SIRT3在腎臟疾病中發(fā)揮保護作用。Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑誘導的急性腎損傷動物模型中，重組腎素酶通過上調SIRT3的表達，減少線粒體分裂和ROS生成，抑制氧化應激，從而能夠減輕順鉑誘導的急性腎損傷。Wang等[16]通過體內外研究發(fā)現(xiàn)，激活SIRT3可誘導線粒體生物合成，并防止腎氧化應激和脂質蓄積。但是關于SIRT1的變化對SIRT3表達的影響卻鮮有報導。本研究結果提示，在ZDF大鼠模型中，腎組織SIRT1和SIRT3表達均降低，而SIRT1過表達組SIRT3表達明顯升高，提示SIRT1可促進SIRT3的表達，進而改善線粒體自噬功能。Kwon等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可調節(jié)SIRT3的乙?；剑琒IRT1活性的降低可使SIRT3乙?；缴?，從而使其活性和穩(wěn)定性降低，導致線粒體抗氧化功能降低。由此，筆者推測SIRT1表達的增加，除了可使其他底物蛋白去乙?；猓€可使SIRT3表達增加，并抑制其乙?；?，從而改善線粒體功能。

綜上所述，SIRT1表達增加對ZDF大鼠腎臟有保護作用，其部分機制可能與促進SIRT3的表達及活性增加，進而改善線粒體的功能，減輕TI有關。不過本研究只是較粗淺地探討了SIRT1與SIRT3的相互關系，要進一步明確其相互作用，還有待進一步深入研究。