張靖柯，呂錦錦，李 孟，魏俊俊，鄭曉珂，馮衛(wèi)生

河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，鄭州 450046

地黃是玄參科地黃屬植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根，在中國傳統(tǒng)用藥中具有幾千年的藥用歷史。產(chǎn)地主要集中在河南、山西、山東等地，以河南焦作為其道地產(chǎn)區(qū)，目前各地也多有栽培。在臨床用藥中，地黃有鮮地黃，生地黃以及熟地黃三種飲片形式，其臨床應(yīng)用以及藥性藥效均存在較大的差異。鮮地黃味甘，性苦、寒。歸心、肝、腎經(jīng)。具有清熱生津，涼血止血的功效。生地黃味甘性寒。歸心、肝、腎經(jīng)。具有清熱涼血，養(yǎng)陰生津的功效。熟地黃Rehmanniae Radix Praeparata為生地黃的炮制加工品，味甘性微溫，歸肝、腎經(jīng)。補(bǔ)血滋陰，益精填髓[1]。前期課題組對鮮地黃、地黃葉以及生地黃都進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究[2-6]，并且從九蒸九曬熟地黃中也分離得到了6個(gè)生物堿類化合物[7]。目前研究報(bào)道熟地黃主要含有多糖類[8]，苯乙醇苷類[9]、核苷類[10]、環(huán)烯醚萜類[11]、紫羅蘭酮類[12]以及多種微量元素等化合物。熟地黃現(xiàn)代藥理活性主要表現(xiàn)為抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗抑郁和抗突變[13-16]等方面的作用。

紫羅蘭酮類化合物廣泛存在于地黃屬植物中，具有環(huán)化異戊二烯結(jié)構(gòu)單元，有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[17,18]。有研究表明[19]紫羅蘭酮類化合物對鼠黑色素瘤(B16)細(xì)胞具有抑制作用。因此本實(shí)驗(yàn)對從九蒸九曬熟地黃中分離得到的紫羅蘭酮類化合物進(jìn)行了人黑色素瘤A375細(xì)胞細(xì)胞毒活性的篩選研究。豐富和完善了“九蒸九曬”熟地黃的相關(guān)化學(xué)成分研究，并為其開展進(jìn)一步的抗腫瘤研究提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Bruker AVANCE Ⅲ 500核磁共振儀(TMS內(nèi)標(biāo))(Bruker)；Bruker maxis HD mass spectrometer,Shimadzu UV-2401PC apparatus；Waters Alliance系列2695高效液相系統(tǒng)；Thermo NicoletIS 10紅光譜儀(美國)；旋光儀(Rudolph，美國)；Thermo EVO 300紫外分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)；LC-52半制備液相色譜儀(賽普銳思科技有限公司)；Reprosil-Pur120 C18-AQ色譜柱(德國)；CHIRALPAK AD-H色譜柱(大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本，東京理化)；二氧化碳培養(yǎng)箱(上海STIK)；超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán))；倒置顯微鏡(Nikon)。

1.1.2 試劑

柱層析填料Diaion HP-20(日本，三菱化學(xué)公司)；Toyopearl HW-40(日本，TOSOH公司)；Sephadex LH-20(瑞士，Parmacia Biotech公司)；柱層析用硅膠(100～200、200～300目)、薄層層析硅膠(青島海洋化工廠)。

甲醇(色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；甲醇(分析純，天津市富宇化工有限公司)；乙腈(色譜純，美國天地有限公司)；A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)；培養(yǎng)皿(Corning)；E-Plate板96孔板；胰蛋白酶；DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；DMSO(Solarbio)；PBS緩沖液等為自配。

1.1.3 藥材

本實(shí)驗(yàn)所用熟地黃2017年8月購自河南省禹州市青山藥業(yè)有限公司(經(jīng)九蒸九曬方法炮制)，標(biāo)本(編號(hào)20170907)存放于河南中醫(yī)藥大學(xué)藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取和分離

干燥熟地黃飲片10 kg，剪碎后加10倍量70%的含水丙酮加熱回流提取3次，提取液過濾，合并濾液進(jìn)行減壓濃縮，真空干燥，得到熟地黃總提取物浸膏4.4 kg。將總提物浸膏加3 L水溶解分散，加95%乙醇調(diào)節(jié)至醇濃度80%進(jìn)行醇沉，靜置24 h后，取上清液，減壓濃縮得到總浸膏。浸膏加8 L水溶解，然后經(jīng)Diaion HP-20大孔吸附樹脂柱，依次用水、10%、20%、30%、50%、70%以及95% EtOH進(jìn)行梯度洗脫，得到7個(gè)洗脫組分，即Fr.1～Fr.7。20% EtOH(Fr.3)水溶解后用Sephadex LH-20凝膠柱[甲醇∶水(V/V)=0∶100→100∶0] 梯度洗脫，洗脫組分經(jīng)薄層硅膠色譜檢識(shí)，合并相同組分得到Fr.3-1～Fr.3-4。其中Fr.3-1組分5%甲醇溶解用中壓制備(ODS)柱，甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫得到Fr.3-1-1～3-1-3。Fr.3-1-2經(jīng)半制備液相Reprosil-Pur 120 C18-AQ色譜柱(CH3CN∶H2O=12∶88)流速為：3 mL/min，保留時(shí)間(tR=27.87 min)洗脫得到化合物1(3.40 mg)。Fr.3.3溶解后經(jīng)Toyopearl HW-40C凝膠柱，30%甲醇洗脫得到Fr.3-3-1～Fr.3-3-4。Fr.3-3-2用半制備液相Reprosil-Pur120 C18-AQ色譜柱(CH3CN∶H2O=10∶90)流速：3 mL/min，保留時(shí)間(tR=21.36 min)得到化合物2(4.23 mg)。95% EtOH洗脫組分(Fr.7)甲醇溶解后上硅膠柱。用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇依次洗脫得到Fr.7-1～Fr.7-4。其中Fr.7-1經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱甲醇洗脫，得到Fr.7-1-1。Fr.7-1-1甲醇溶解，進(jìn)行硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(40∶1)等度洗脫，最終得到化合物3(7.91 mg)。

1.2.2 細(xì)胞毒活性檢測

采用MTT法探究化合物1～3對A375人惡性黑色素瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用[20]。將A375細(xì)胞置于培養(yǎng)基中37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于E-Plate 96孔板中，24 h后，實(shí)驗(yàn)分為正常對照組和三個(gè)給藥組?；衔?～3(25 μM)分別刺激A375細(xì)胞48 h，通過MTT法檢測各組細(xì)胞活力。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分析數(shù)據(jù)顯著性差異，P< 0.01表明具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色結(jié)晶性粉末； -64.0(c0.02，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z469.203 9 [M+Na]+(calcd for C21H34O10Na，469.204 4)確定化合物的分子式為C21H34O10；UVλmax(CH3OH)/nm(logε)197(0.35)，263(1.05)；IRνmax：3 387、2 929、1 679、1 522、1 459、1 263、1 078、849 cm-1；IR光譜提示存在羥基(3 387 cm-1)和羰基信號(hào)(1 611 cm-1)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ6.68(1H，d，J=16.1，H-7)和6.39(1H，d，J=16.1 Hz，H-8)提示化合物中存在一個(gè)反式雙鍵；δH5.80(1H，s，H-10)推測為雙鍵上的氫信號(hào)；δH1.03(3H，s，1α-CH3)、0.89(3H，s，1β-CH3)、0.96(3H，s，5-CH3)以及2.30(3H，s，9-CH3)為四個(gè)甲基氫信號(hào)；δH4.30(1H，d，J=7.8 Hz,H-1′)為糖的端基氫信號(hào)，δH3.85(1H，d，J=11.8 Hz，H-6′a)和3.67(1H，dd，J=11.8，5.3 Hz，H-6′b)為葡萄糖6位特征氫信號(hào)，結(jié)合δH3.18～3.73(4H，m，H-2′～5′)推測該化合物中存在一個(gè)葡萄糖的結(jié)構(gòu)片段。根據(jù)偶合常數(shù)J=7.8 Hz，判斷該葡萄糖為β構(gòu)型。13C NMR(125 MHz，CD3OD)共顯示21個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合DEPT 135譜可知，δC18.8(1α-CH3)、22.7(1β-CH3)、26.9(5-CH3)和14.3(9-CH3)為4個(gè)甲基信號(hào)；δC27.0(C-3)，35.9(C-4)，62.8(C-6′)為3個(gè)仲碳信號(hào)；δC85.4(C-2)，139.3(C-7)，134.6(C-8)，119.7(C-10)，106.6(C-1′)，75.4(C-2′)，78.2(C-3′)，71.7(C-4′)，77.7(C-5′)為9個(gè)叔碳信號(hào)；δC45.2(C-1)，75.6(C-5)，82.4(C-6′)，153.8(C-9)，170.7(C-11)為5個(gè)季碳信號(hào)；其中δC170.7為-COOH的特征碳信號(hào)，結(jié)合其信號(hào)特征，推測該化合物可能為倍半萜苷類化合物(見圖1)。將其碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]中sec-hydroxyaeginetic acid進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)化合物1中多一組葡萄糖的碳信號(hào)(δC106.6、75.4、78.2、71.7、77.7、62.8)且δC74.5(C-2)處的碳信號(hào)向低場區(qū)發(fā)生位移至δC85.4處，根據(jù)苷化位移以及HMBC譜，葡萄糖端基氫δH4.30(H-1′)與δC85.4(C-2)處的碳遠(yuǎn)程相關(guān)(見圖2)，確定葡萄糖連接在sec-hydroxyaeginetic acid苷元的C-2位上。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compound 1

圖2 化合物1的HMBC、1H-1H COSY相關(guān)Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物1的相對構(gòu)型主要是通過NOESY譜進(jìn)行確定。在NOESY譜中，δH3.53(H-2)與δH0.82(1β-CH3)、3.78(6-OH)具有NOE關(guān)系位于同側(cè)，并且3.78(6-OH)與0.90(5-CH3)、δH3.53(H-2)具有NOE相關(guān)，由此可判斷H-2/1β-CH3/5-CH3/6-OH空間取向一致為β；同時(shí)δH4.14(5-OH)與δH1.04(1α-CH3)具有NOE關(guān)系提示5-OH/1α-CH3位于一側(cè)為α。由此可以判斷化合物1的相對構(gòu)型。根據(jù)以上解析，確定化合物1的結(jié)構(gòu)。經(jīng)查閱scifinder未見相關(guān)報(bào)道，確定為新化合物并將其命名為sec-hydroxyaeginetic acid-2-O-β-D-glucopyranoside，其碳?xì)鋽?shù)據(jù)歸屬見表1?；衔?的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)Table 1 1H and 13C NMR spectroscopic data of compound 1

化合物2無定型粉末； -76.5(c0.018，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z323.146 3 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：3.50(1H，d，J=9.8 Hz，H-2)，3.86(1H，m，H-3)，1.90(1H，t，H-4α)，1.81(1H，dd，J=13.0，4.8 Hz，H-4β)，6.68(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.40(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，5.80(1H，s，H-10)，2.30(3H，s，H-12)，1.12(3H，s，1α-CH3)，0.90(3H，s，1β-CH3)，1.07(3H，s，5-CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：45.6(C-1)，79.4(C-2)，69.3(C-3)，44.1(C-4)，77.1(C-5)，81.9(C-6)，139.3(C-7)，134.8(C-8)，153.7(C-9)，119.8(C-10)，170.6(C-11)，14.2(C-12)，18.9(1α-CH3)，23.3(1β-CH3)，26.9(5-CH3)。以上數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)[22]，確定化合物為frehmaglutin A。

化合物3無色晶體； -32.1(c0.025，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z249.146 4 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ：1.17(1H，m，H-2a)，1.69(1H，m，H-2b)，1.89(1H，m，H-3a)，1.38(1H，m，H-3b)，1.47(1H，m，H-4a)，1.80(1H，m，H-4b)，7.42(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.32(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，δH2.30(3H，s，H-10)，1.24(3H，s，1α-CH3)，0.80(3H，s，1β-CH3)，1.06(3H，s，5-CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)，δ：39.6(C-1)，37.3(C-2)，18.9(C-3)，36.6(C-4)，75.5(C-5)，80.6(C-6)，153.3(C-7)，131.8(C-8)，201.4(C-9)，δC27.4(C-10)，25.7(1α-CH3)，27.4(1β-CH3)，27.0(5-CH3)。以上數(shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)[21]，確定化合物為dihydroxy-β-ionone。

2.1.2 酸水解

化合物1(1 mg)，加入1 mL三氟乙酸溶液(2 mol/L)，加熱回流3 h，所得水解液用乙酸乙酯萃取3次，將水層濃縮至干[23]。加少量乙醇溶解，經(jīng)HPLC分析采用蒸發(fā)光散射檢測器，色譜柱為CHIRALPAKAD-H(250 mm × 4.6 mm)，流動(dòng)相為正己烷-乙醇-三氟乙酸(750∶250∶0.25)，流速0.5 mL/min。通過比較樣品與D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，確定化合物1中葡萄糖的絕對構(gòu)型為D-葡萄糖(tR=18.3 min，D-glucose)。

2.1.3 絕對構(gòu)型的確定

化合物1的絕對構(gòu)型通過與文獻(xiàn)對比ECD圖譜確定。在ECD譜中(見圖3)，222 nm處有一個(gè)正的Cotton效應(yīng)，265 nm處有一個(gè)負(fù)的Cotton效應(yīng)，與sec-hydroxyaeginetic acid[21]的ECD圖譜一致從而確定該化合物的絕對構(gòu)型為2S，5R，6R。

圖3 化合物1的ECD譜圖Fig.3 ECD spectra of the compound 1

2.2 細(xì)胞毒活性

本實(shí)驗(yàn)測試了從九蒸九曬熟地黃中分離得到的三個(gè)紫羅蘭酮類化合物的細(xì)胞毒活性，結(jié)果顯示，化合物1～3在25 μM濃度下能顯著性降低人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的細(xì)胞活力，提示其可能具有抗人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞的活性(如表3所示)。

表3 化合物1～3對A375細(xì)胞活力的影響Table 3 Cytotoxic activity of compounds 1-3 on A375 cells

3 結(jié)論與討論

地黃為玄參科地黃屬植物地黃的新鮮或干燥塊根，經(jīng)炮制加工以鮮地黃，生地黃以及熟地黃三種飲片形式應(yīng)用于臨床。地黃在炮制加工過程中，其藥性藥效均發(fā)生了改變，這種改變可能與其內(nèi)在化學(xué)成分的改變密切相關(guān)。有研究表明[24]，炮制加工過程中熟地黃5-羥甲基糠醛(5-HMF)的含量顯著高于生地黃，Zou等[25]利用一測多評法同時(shí)測定熟地黃中4種苯乙醇苷研究，結(jié)果表明地黃經(jīng)炮制加工后4種苯乙醇苷成分含量均有所下降。Li等[26]研究表明，生地黃中的地黃苷A和地黃苷D的含量均比熟地黃中含量高。Jia等[14]對鮮地黃，生地黃和熟地黃中水蘇糖在炮制過程中的變化研究，結(jié)果表明鮮地黃中水蘇糖含量最高，其次是生地黃，熟地黃中含量最低。Zhang等[27]采用HPLC建立了同時(shí)測定了生地黃和熟地黃中5個(gè)苷類成分含量的方法，為開展生地黃、不同炮制方法制備熟地黃的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了參考。為補(bǔ)充和完善熟地黃的化學(xué)成分，尋找地黃在炮制過程中的差異性成分，開展熟地黃相關(guān)化學(xué)成分研究是非常有必要的。本實(shí)驗(yàn)建立在前期研究的基礎(chǔ)上，對九蒸九曬熟地黃進(jìn)行進(jìn)一步的化學(xué)成分分離純化研究，分離得到3個(gè)紫羅蘭酮類化合物。并對其進(jìn)行了A375細(xì)胞毒活性的初步篩選評價(jià)研究。研究結(jié)果表明化合物1～3均能顯著的抑制A375細(xì)胞活力，具有潛在的抗人黑色素瘤細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)為熟地黃中紫羅蘭酮類化合物對人黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞毒活性的相關(guān)機(jī)制研究提供參考價(jià)值，也為熟地黃藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。