李大山，曾天艷，馬 莎，王文靜，邵立東

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院云南省南藥資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500

肉豆蔻屬于肉豆蔻科植物肉豆蔻(Myristicafragrans)的干燥種仁，被《中國(guó)藥典》2015年版一部收錄，功能與主治：溫中行氣，澀腸止瀉，用于脾胃虛寒，久瀉不止，脘腹脹痛，食少嘔吐[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肉豆蔻的化學(xué)成分主要是木質(zhì)素、苯并呋喃類新木質(zhì)素、非苯并呋喃類新木質(zhì)素[2,3]，而二芳基丙烷類成分的報(bào)道比較少見(jiàn)[4]。肉豆蔻中的化學(xué)成分特別是酚類成分具有廣泛的生物活性，目前的活性研究主要集中在抗炎[5]和抗腫瘤活性[6]兩方面。除此之外，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面如神經(jīng)保護(hù)[7]、抗焦慮[8]、抗菌[9]和治療糖尿病[10]等方面也有相關(guān)報(bào)道。

炎癥已被研究證明是自體免疫紊亂[11]和腫瘤[12]等疾病發(fā)生過(guò)程中共同的病理機(jī)制。當(dāng)免疫細(xì)胞受到炎癥介質(zhì)等物質(zhì)刺激時(shí)，會(huì)促進(jìn)一氧化氮合酶(iNOS)的大量表達(dá)，釋放一氧化氮(NO)引起免疫應(yīng)答，因此抑制NO生成是評(píng)價(jià)化合物抗炎活性的直接指標(biāo)[13]。

傳統(tǒng)的抗炎藥物環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑對(duì)心血管系統(tǒng)和胃粘膜存在著副作用[14]，需研究開(kāi)發(fā)新型抗炎藥物。鑒于前期關(guān)于肉豆蔻中酚類成分的抗炎活性報(bào)道，而同為酚類的二芳基丙烷成分的研究較少[4]，為了豐富其二芳基丙烷類化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)新型抗炎活性的先導(dǎo)化合物，本文對(duì)肉豆蔻果實(shí)丙酮提取物乙酸乙酯部位的二芳基丙烷類成分進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并測(cè)試了分離化合物對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的NO生成抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

肉豆蔻采購(gòu)于昆明螺螄灣藥材市場(chǎng)，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)王文靜教授鑒定為肉豆蔻(Myristicafragrans)，原植物標(biāo)本(20190503)現(xiàn)存于云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑

AM-500 MHz核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；UV-2401A紫外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Affinity-1S紅外光譜儀(日本Shimadzu公司)；VG Auto Spec-3000質(zhì)譜儀(英國(guó)VG PRIMA公司)；薄層層析硅膠GF254和柱層析硅膠(200(300目，青島海洋化工有限公司)；RP-18反相材料(40～63 μm，德國(guó)Merk公司)；Sephadex LH-20(40～70 μm，瑞士Amersham Biosciences AB公司)；提取和柱層析溶劑石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇(工業(yè)級(jí)，重蒸后使用)；其余試劑均為分析純。

1.3 提取與分離

干燥的肉豆蔻果實(shí)3.0 kg，粉碎后用70%的丙酮/水溶液(10 L)室溫浸泡提取3次(每次2天)，提取液合并，減壓蒸餾出去大部分丙酮/水得浸膏，加入2 L水，然后分別用石油醚，乙酸乙酯各萃取3次(3×2 L)，減壓回收萃取溶劑后得乙酸乙酯部分230 g。

乙酸乙酯部分用500 g硅膠(200～300目)拌樣，1.0 kg硅膠(200～300目)進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚/丙酮(100∶0→20∶1→10∶1→5∶1→1∶1)梯度洗脫，TLC檢測(cè)并合并相同的部分，得到5個(gè)組分Fr.1～5。

Fr.4(33 g)采用反相RP-18進(jìn)行柱層析，MeOH/H2O(30∶70→95∶5)梯度洗脫，得到4個(gè)組分Fr.4.1～Fr.4.4。Fr.4.2(2.3 g)經(jīng)Sephadex LH-20(CHCl3/MeOH，3∶2)凝膠柱層析得到3個(gè)組分Fr.4.2.1～Fr.4.2.3。Fr.4.2.2(243 mg)依次通過(guò)硅膠柱層析(石油醚/丙酮，20∶1→5∶1；氯仿/丙酮，15∶1→5∶1)得到化合物1(8 mg)、2(11 mg)和4(16 mg)。

Fr.5(26 g)采用反相RP-18進(jìn)行柱層析，MeOH/H2O(20∶80→95∶5)梯度洗脫，得到4個(gè)組分Fr.5.1～Fr.5.4。Fr.5.2(1.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20(CHCl3/MeOH，3:2)凝膠柱層析得到3個(gè)組分Fr.5.2.1～Fr.5.2.3。Fr.5.2.2(122 mg)依次通過(guò)硅膠柱層析(氯仿/甲醇，20∶1→5∶1；氯仿/丙酮，10∶1→1∶1)得到化合物3(21 mg)和5(18 mg)。

1.4 NO生成抑制活性檢測(cè)

采用Griess法對(duì)分離化合物1～5進(jìn)行體外抗炎活性篩選，評(píng)價(jià)其抑制NO生成活性。將小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞接種至96孔板，用1 μg/mL LPS進(jìn)行誘導(dǎo)刺激，同時(shí)加入待測(cè)化合物(2.5、5.0、10.0和20.0 μM)處理，設(shè)置不含藥物組和L-NMMA陽(yáng)性藥物組做對(duì)照。細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)后取培養(yǎng)基檢測(cè)NO生成，在540 nm處測(cè)定吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。在剩余培養(yǎng)基中加入MTS進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)，排除化合物對(duì)細(xì)胞的毒性影響。NO生成抑制率=[(非藥物處理組OD540nm-樣品組OD540nm)/非藥物處理組OD540nm]× 100%。半數(shù)抑制濃度(IC50，50% concentration of inhibition)按Reed&Muench法計(jì)算[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)解析

化合物1～5的結(jié)構(gòu)如圖1所示(*標(biāo)示的是新化合物)。

圖1 肉豆蔻果實(shí)中化合物1～5的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-5 from the fruits of M.fragrans

化合物1淡黃色無(wú)定型粉末；UV(MeOH)λmax(logε)202(4.55)，223(3.98)nm；IR(KBr)νmax3 371，2 932，2 848，1 608，1 511，1 450，1 370，1 286，1 238，1 180，1 111，1 029，816；1H和13C NMR見(jiàn)表1。結(jié)合HR-EI-MS：m/z258.125 5 [M]+(calcd for C16H18O3，258.125 6)和1H NMR、13C NMR(DEPT)譜，確定分子式為C16H18O3。紅外光譜在νmax3 371cm-1有吸收，表明有羥基的存在。在其1H NMR譜(見(jiàn)表1)中可觀察到一個(gè)ABX自旋系統(tǒng)6.70(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.77(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.61(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-6′)和一個(gè)AA′BB′自旋系統(tǒng)7.09(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2″和H-6″)，6.83(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3″和H-5″)以及1個(gè)甲氧基信號(hào)3.80(3H，s，4″-OMe)。在其13C NMR(DEPT)譜(見(jiàn)表1)中可觀察到14個(gè)碳信號(hào)，包括10個(gè)芳基碳信號(hào)[其中δC129.4(d，C-2″和C-6″)和113.9(d，C-3″和C-5″)分別為兩個(gè)碳信號(hào)的重疊，即這10個(gè)芳基碳信號(hào)共包含12個(gè)碳原子]，3個(gè)亞甲基和1個(gè)甲氧基。綜合以上的高分辨質(zhì)譜和核磁數(shù)據(jù)分析，可以推測(cè)化合物1是二芳基丙烷類化合物。

表1 化合物1的1H(500 MHz)和13C(125 MHz)NMR的核磁數(shù)據(jù)(CDCl3)Table 1 1H (500 MHz) and 13C (125 MHz) NMR data of compound 1 (CDCl3)

通過(guò)文獻(xiàn)查閱比較化合物1和已報(bào)道的化合物horsfielenide E(1-(3′,4′-methylenedioxyphenyl)-3-(4′′-methoxyphenyl)propane)[15]的1H NMR和13C NMR(DEPT)譜數(shù)據(jù)，可以看出化合物1和horsfielenide E具有相似的分子骨架，兩者不同之處在于horsfielenide E的C-3′和C-4′位連接的是亞甲二氧基(-OCH2O-)，而化合物1的C-3′和C-4′分別為酚羥基取代。

通過(guò)二維核磁1H-1H COSY、HSQC、HMBC譜對(duì)化合物的碳、氫信號(hào)進(jìn)行了全歸屬(見(jiàn)表1)。在1H-1H COSY譜中(見(jiàn)圖2)，H-1/H-2，H-2/H-3的相關(guān)信號(hào)確證了C1-C2-C3的連接方式。在HMBC譜中，δH2.52(2H，t，J= 7.5 Hz，H-1)與135.8(s，C-1′)，115.7(d，C-2′)，121.0(d，C-6′)有相關(guān)信號(hào)，表明C-1連接在一個(gè)芳環(huán)的C-1′位上；2.57(2H，t，J= 7.5 Hz，H-3)與134.6(s，C-1″)，129.4(d，C-2″和C-6″)有相關(guān)信號(hào)，表明C-3連接在另一個(gè)芳環(huán)的C-1″上。3.80(3H，s，4″-OMe)與157.8(s，C-4″)有相關(guān)信號(hào)，表明甲氧基連接在C-4″上。綜上所述，化合物1的被確定為如圖1所示結(jié)構(gòu)，命名為1-(3′,4′-dihydroxyphenyl)-3-(4″-methoxyphenyl)-propane。化合物1的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1關(guān)鍵的1H-1H COSY和HMBC相關(guān)Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations for 1

化合物2無(wú)色無(wú)定形粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.02(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6″)，6.83(1H，d，H-5′)，6.74(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2′)，6.70(1H，dd，J= 8.0，1.9 Hz，H-6′)，6.44(1H，dd，J= 8.2，2.5 Hz，H-5″)，6.40(1H，d，J= 2.5 Hz，H-3″)，3.88、3.75(各3H，s，3′，4″-OMe)，2.75～2.51(4H，m，H-1，3)，2.09～1.70(2H， m， H-2)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：159.2(s，C-4″)，154.6(s，C-2″)，146.7(s，C-3′)，144.9(s，C-4′)，134.5(s，C-1′)，130.7(d，C-6″)，121.5(s，C-6′)，120.8(d，C-1″)，114.6(d，C-5′)，111.4(d，C-2′)，106.3(d，C-5″)，102.2(d，C-3″)，56.0(q，C-4″-OMe)，55.3(q，C-3′-OMe)，35.4(d，C-3)，32.0(d，C-1)，28.9(d，C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16,17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為1-(4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl)-3-(2″-hydroxy-4″-methoxyphenyl)-propane。

化合物3無(wú)色油狀物；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：7.07(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2′)，6.97(1H，J= 8.4 Hz，H-6″)，6.90(1H，dd，J= 8.1，1.8 Hz，H-6′)，6.83(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5′)，6.44(1H，dd，J= 8.4，2.6 Hz，H-5″)，6.38(1H，d，J= 2.5 Hz，H-3″)，4.96(1H，dd，J= 10.3，2.3 Hz，H-1)，3.86(3H，s，3′-OMe)，3.74(3H，s，4″-OMe)，2.93～2.86(1H，m，H-3a)，2.70(1H，dt，J= 16.2，4.3 Hz，H-3b)，2.17～2.12(1H，m，H-2a)，2.05～1.98(1H，m，H-2b)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：160.1(s，C-4″)，157.0(s，C-2″)，148.3(s，C-3′)，147.3(s，C-4′)，134.3(s，C-1′)，130.9(d，C-6″)，119.7(d，C-6′)，115.5(d，C-5′)，114.7(s，C-1″)，110.6(d，C-2′)，107.7(d，C-5″)，102.4(d，C-3″)，78.6(d，C-1)，56.3(q，C-3′-OMe)，55.4(q，C-4″-OMe)，30.8(t，C-3)，25.1(t，C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為horsfielenidine A。

化合物4淡黃色無(wú)定型粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.91(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6″)，6.69～6.65(3H，m，H-2′，5′，6′)，6.51(1H，d，J= 1.8 Hz，H-3″)，6.42(1H，dd，J= 8.2，1.8 Hz，H-5″)，5.92(2H，s，H-7(-OCH2O-)，4.10(1H，m，H-2)，3.77(3H，s，4″-OMe)，2.76～2.54(4H，m，H-1，3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：159.9(s，C-4″)，156.6(s，C-2″)，147.5(s，C-3′ or 4′)，145.8(s，C-C-4′ or 3′)，132.0(s，C-1′)，131.4(d，C-6″)，122.2(d，C-6′)，117.3(s，C-1″)，109.5(d，C-2′ or 5′)，108.5(d，C-5′ or 2′)，106.2(d，C-5″)，102.8(d，C-3″)，100.8(t，C-7′-OCH2O-)，74.9(d，C-2)，55.2(q，C-4″-OMe)，42.9(t，C-1 or 3)，38.1(t，C-3 or 1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為1-(2′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)-3-(3″,4″-methylenedioxyphenyl)-propan-2-ol。

化合物5黃色粉末;1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.83(1H，d，J= 1.9 Hz，H-2′)，6.80(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6″)，6.73(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.66(1H，dd，J= 8.0，1.9 Hz，H-6′)，6.34(1H，d，J= 2.4 Hz，H-3″)，6.26(1H，dd，J= 8.1，2.5 Hz，H-5″)，4.13～4.09(1H，m，H-2)，3.82(3H，s，3′-OMe)，2.78～2.63(4H，m，H-2，H-3)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：158.3(s，C-4′′)，158.1(s，C-2′′)，148.2(s，C-3′)，145.9(s，C-4′)，133.0(d，C-6′′)，131.3(s，C-1′)，122.9(d，C-6′)，117.8(s，C-1′′)，115.7(d，C-5′)，114.0(d，C-2′)，107.5(d，C-5′′)，104.6(d，C-3′′)，75.2(d，C-2)，56.3(q，3′-OMe)，43.9(t，C-1)，39.1(t，C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為virolanol B。

2.2 抗炎活性評(píng)價(jià)

采用Griess法測(cè)定了化合物1對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞NO生成抑制活性的篩選，結(jié)果見(jiàn)表2。與陽(yáng)性對(duì)照一氧化氮合酶抑制劑NG-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA，IC50=10.18 μmol/L)相比，化合物1對(duì)RAW264.7細(xì)胞有明顯的NO生成抑制作用(IC50=4.00 μmol/L)。

表2 化合物1體外NO生成抑制活性Table 2 In vitro NO production inhibitory activities of compound 1

3 結(jié)論

本文對(duì)肉豆蔻果實(shí)70%丙酮提取物的乙酸乙酯部位進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，共分離和鑒定了5個(gè)二芳基丙烷類化合物，其中化合物1為新化合物。對(duì)化合物的NO生成抑制活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，化合物1(IC50=4.00 μmol/L)對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的NO生成抑制作用明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照L-NMMA(IC50=10.18 μmol/L)。本研究結(jié)果可以為拓寬中藥肉豆蔻抗炎的藥用范圍提供物質(zhì)基礎(chǔ)。