衛(wèi)智權(quán)，包傳紅，陳儀新，閻 莉

1廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院，南寧 530200

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最主要的中樞神經(jīng)退行性疾病之一，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征，伴隨社會(huì)老齡化程度的逐漸加深，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。國際阿爾茨海默病協(xié)會(huì)發(fā)布的世界阿爾茨海默病報(bào)告的數(shù)據(jù)顯示，全球共有約5 000萬AD患者，預(yù)計(jì)到2030年將達(dá)到8 200萬，到2050年將達(dá)1.52億。神經(jīng)組織β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)異常增加不僅被認(rèn)為是AD的主要病理變化之一，也是導(dǎo)致AD神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要原因[2]。關(guān)于Aβ的神經(jīng)細(xì)胞毒性的研究證據(jù)不斷累積，然而，已經(jīng)完成的數(shù)個(gè)特異性清除Aβ的藥物臨床試驗(yàn)均以失敗告終，使得藥物研發(fā)人員的注意力重新轉(zhuǎn)向增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對Aβ細(xì)胞毒作用的耐受能力，但是目前尚未有商品化的相應(yīng)新藥推出[3]。

中醫(yī)藥治療AD具有較好的改善患者認(rèn)知能力的效果。對于AD的病因病機(jī)的認(rèn)識，中醫(yī)扶陽學(xué)派認(rèn)為，“陰化太過，陽化不足，內(nèi)生濁邪”是AD的主要病因病機(jī)，“元陽虛衰”、“陽虛陰實(shí)”在AD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了主導(dǎo)性的作用[4]。附子被譽(yù)為中藥“回陽救逆第一品”，具有顯著的補(bǔ)火助陽功效，為中醫(yī)扶陽學(xué)派廣泛用于AD的臨床治療，創(chuàng)制了五臟溫陽化瘀湯等一批臨床應(yīng)用療效較好的復(fù)方制劑[5]。烏頭堿(aconitine)為附子的重要活性成分，既有的研究發(fā)現(xiàn)烏頭堿具有強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，其藥理作用機(jī)制與激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)有關(guān)[6-8]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)控的重要的下游靶激酶，Tyr216位點(diǎn)磷酸化的GSK-3β為其活化形式，Aβ誘導(dǎo)的GSK-3β過度活化被認(rèn)為是AD進(jìn)程中神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要原因之一[9]。迄今為止，尚無證據(jù)表明烏頭堿能夠減輕Aβ介導(dǎo)的GSK-3β過磷酸化而導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

本研究采用Aβ1-40體外誘導(dǎo)SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷的細(xì)胞模型，探討烏頭堿是否基于調(diào)控GSK-3β的Tyr216位點(diǎn)磷酸化水平而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，有助于在分子水平理解中藥附子用于AD臨床治療的分子機(jī)制。

圖1 烏頭堿的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of aconitine

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

烏頭堿(美國Sigma公司，批號16938)；Aβ1-40(美國Sigma公司，批號028M4864V)；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號1896978)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司，批號1828728)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(美國Gibco公司，批號8117266)；Accutase膠原酶細(xì)胞解離液(美國eBioscience公司，批號E00023-1662)；CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，批號DV652)。人乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)ELISA檢測試劑盒(武漢華美公司，批號H05016505)；AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI 凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶公司，批號20181219)；組織細(xì)胞RIPA裂解液(北京索萊寶公司，批號20190903)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶公司，批號20190910)；蛋白電泳預(yù)制膠(北京索萊寶公司，批號20190923)。兔抗人GSK-3β單抗(美國Abcam公司，批號GR312697-8)；兔抗人GSK-3β(phospho Y216)單抗(美國Abcam公司，批號GR258576-24)；小鼠抗人GAPDH單抗(美國Abcam公司，批號GR202362-1)；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(上海生工公司，批號F902AA0024)；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(上海生工公司，批號E326AA0001)。

1.3 主要儀器

Mini-PROTEAN型垂直電泳儀和Mini Trans-blot型轉(zhuǎn)印儀(美國Bio-Rad公司)；ChemiDoc成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；5430R型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；LSR Fortessa多色分析流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

2 方法

2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

DMEM高糖培養(yǎng)基，含10% FBS、100 IU/mL的青霉素、100 mg/L的鏈霉素，初始細(xì)胞濃度2×105/mL，置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2，飽和濕度)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞長滿約70% 時(shí)進(jìn)行傳代。

2.2 烏頭堿的細(xì)胞安全性測試與Aβ1-40誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，初始細(xì)胞濃度1×105/mL。設(shè)置無藥物處理的正常對照組，以及每孔加入烏頭堿終濃度分別為1、2.5、5、10、20 nmol/L的烏頭堿各濃度處理組，各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h，加入CCK8溶液10 μL，繼續(xù)孵育2 h。收集培養(yǎng)上清液，以酶標(biāo)儀于450 nm處測定光吸收度。根據(jù)細(xì)胞安全性測試數(shù)據(jù)選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)的烏頭堿安全濃度。

參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法建立Aβ1-40誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型[10]。取對數(shù)生長期的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，初始細(xì)胞濃度1×105/mL。設(shè)置正常對照組(normal)、Aβ1-40細(xì)胞損傷模型對照組(model)，后者加入終濃度20 μmol/L的Aβ1-40孵育24 h誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。24 h后收集培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書以ELISA檢測培養(yǎng)上清液LDH濃度，收集細(xì)胞以AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI法流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，評價(jià)建模方法的有效性。

2.3 烏頭堿干預(yù)Aβ1-40誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，初始細(xì)胞濃度1×105/mL。設(shè)置正常對照組(normal)、Aβ1-40細(xì)胞損傷模型對照組(model)、烏頭堿干預(yù)組(aconitine)，其中的烏頭堿干預(yù)組以終濃度5 nmol/L的烏頭堿預(yù)孵育12 h，其它兩組不作藥物干預(yù)。12 h后，Aβ1-40細(xì)胞損傷模型對照組與烏頭堿干預(yù)組加入終濃度20 μmol/L的Aβ1-40，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[11]。24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測培養(yǎng)上清液LDH濃度；收集細(xì)胞，部分細(xì)胞用于AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI法流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，其余細(xì)胞用于蛋白免疫印跡檢測GSK-3β的磷酸化水平。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡與壞死

去除培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基，PBS洗3次，膠原酶細(xì)胞解離液消化10 min，加入適量4℃預(yù)冷的PBS，1 000 rpm離心5 min。小心去除上清，加入約1 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞。取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL 流式管中，加入Annexin V-Alexa Fluor 488溶液5 μL，混勻后于室溫避光孵育5 min；加入10 μL PI溶液，并加400 μL PBS，上機(jī)進(jìn)行流式檢測。

2.5 Western blotting檢測細(xì)胞GSK-3β與Tyr216位點(diǎn)磷酸化GSK-3β

去除培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基，PBS洗3次，膠原酶細(xì)胞解離液消化10 min，加入適量4 ℃預(yù)冷的PBS，1 000 rpm離心5 min。小心去除上清，加入10倍體積裂解液4 ℃ 孵育20 min，12 000 rpm離心5 min，取上清，蛋白定量。準(zhǔn)備蛋白電泳預(yù)制膠，蛋白上樣量20 μg。垂直電泳條件為恒壓100 V，指示劑泳動(dòng)至凝膠中下部時(shí)停止。采用濕法轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃搖床一抗孵育過夜，GSK-3β單抗、GSK-3β(phospho Y 216)單抗、GAPDH單抗稀釋倍數(shù)均為1∶1 200。一抗孵育結(jié)束，二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育60 min，ECL超敏化學(xué)發(fā)光液孵育3 min，即以ChemiDoc成像系統(tǒng)測定并計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度的比值作為蛋白的相對表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)與形態(tài)觀察

細(xì)胞在DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS)生長速度稍慢，每5～7天可以1∶3傳代1次。細(xì)胞貼壁生長，具有一定程度聚集生長傾向。鏡下可見細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形，具有數(shù)個(gè)明顯的尖細(xì)突起，部分細(xì)胞具有較長的類似神經(jīng)細(xì)胞樣突觸，如圖2。

圖2 SH-SY5Y細(xì)胞Fig.2 SH-SY5Y cell

3.2 烏頭堿對SH-SY5Y細(xì)胞的安全性測試

與未經(jīng)藥物處理的正常對照組比較，以終濃度為1、2.5、5 nmol/L的烏頭堿孵育SH-SY5Y細(xì)胞24 h，對于細(xì)胞的增殖活性無明顯影響；以終濃度為10、20 nmol/L的烏頭堿孵育SH-SY5Y細(xì)胞24 h，細(xì)胞增殖活性降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度烏頭堿的細(xì)胞安全性Fig.3 Cell safety of aconitine at different concentrations注：與正常對照組比較，*P<0.01。Note:Compared with normal control,*P<0.01.

3.3 Aβ1-40誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型的建立

與正常對照組比較，模型對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平顯著提升，細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞壞死率亦顯著增加，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖4。

圖4 Aβ1-40誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷Fig.4 SH-SY5Y cell damage induced by Aβ1-40注：與正常對照組比較，*P<0.01。Note:Compared with normal control,*P<0.01.

3.4 烏頭堿對Aβ1-40誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH水平、細(xì)胞凋亡與壞死的影響

與正常對照組比較，模型對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平顯著提升，細(xì)胞凋亡率與壞死率亦明顯增加，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以5 nmol/L的烏頭堿預(yù)處理之后，與模型對照組比較，烏頭堿干預(yù)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率與壞死率亦明顯下降，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖5A、B、D。

3.5 烏頭堿對Aβ1-40誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞GSK-3β蛋白Tyr216位點(diǎn)磷酸化的影響

與正常對照組比較，模型對照組細(xì)胞GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著提升，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以5 nmol/L的烏頭堿預(yù)處理之后，與模型對照組比較，烏頭堿干預(yù)組細(xì)胞GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著降低，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖5C、E。

圖5 烏頭堿減輕Aβ1-40誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷Fig.5 Alleviation of aconitine on SH-SY5Y cell damage induced by Aβ1-40注：與正常對照組比較，*P<0.01。與模型對照組比較，△P<0.01。Note:Compared with normal control,*P<0.01.Compared with model control, △P<0.01.

4 討論

早在典型的認(rèn)知功能障礙和行為損害等AD癥狀出現(xiàn)之前約15～20年，甚至更早的階段，對神經(jīng)細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的Aβ就已經(jīng)在AD患者大腦中發(fā)生了病理性聚集，然而此時(shí)并無明顯的記憶減退癥狀。Aβ對神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性,不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥，還能夠干擾細(xì)胞膜離子通道開放進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子濃度梯度失衡、細(xì)胞膜跨膜電位異常,并直接損傷膽堿能神經(jīng)傳導(dǎo)功能而導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)信號傳遞障礙,以及直接誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[12]。當(dāng)患者表現(xiàn)出典型的認(rèn)知與行為能力損害的時(shí)候，其大腦的神經(jīng)細(xì)胞已經(jīng)大量喪失，大腦影像檢查已經(jīng)可以觀察到明顯的腦萎縮，此時(shí)再使用藥物來清除Aβ，已經(jīng)很難獲得理想的臨床療效，這也是AD自于1907年被正式定義以來AD的臨床治療困難重重的原因之一[13]。尋找能夠增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對Aβ細(xì)胞毒作用的耐受能力的有效藥物，并在AD病理進(jìn)程的早期階段進(jìn)行藥物干預(yù)，是有效阻止AD持續(xù)進(jìn)展的藥物治療綜合方案的重要內(nèi)容之一。早期開始治療通常意味著患者需要持續(xù)時(shí)間漫長的藥物治療，必須謹(jǐn)慎權(quán)衡藥物治療的獲益與藥物安全性的風(fēng)險(xiǎn)。考慮到中藥及其有效成分普遍具有較好的安全性，并且其多靶點(diǎn)藥效的特點(diǎn)契合AD這樣的復(fù)雜慢性疾病，早期開始中藥及其有效成分干預(yù)或許是合理的潛在選擇[14,15]。

中醫(yī)扶陽學(xué)派重用附子的溫陽化瘀治則，在AD的臨床治療中獲得了較好的認(rèn)知與行為能力癥狀改善的療效[16,17]。烏頭堿既是附子的重要藥效物質(zhì)，也是引起附子中毒的重要原因，因而附子遣方用藥的權(quán)衡較為復(fù)雜，也是選取烏頭堿作為研究對象的主導(dǎo)性原因。烏頭堿作為附子中的重要生物活性成分，既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其激活PI3K的藥理活性，而PI3K的激活能夠負(fù)調(diào)控Tyr216位點(diǎn)磷酸化導(dǎo)致的GSK-3β活化。GSK-3β參與Aβ的生成、聚集以及后續(xù)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，而Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激也可以誘導(dǎo)GSK-3β的磷酸化激活。此外，過度活化的GSK-3β亦可破壞重要的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的活性，并加速神經(jīng)細(xì)胞軸突變性、阻礙軸突運(yùn)輸，進(jìn)一步加劇認(rèn)知功能障礙。基于上述研究發(fā)現(xiàn)，可以合理推測烏頭堿有助于增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞抵抗Aβ的細(xì)胞毒作用，并且此有益的藥理作用與其抑制GSK-3β在Tyr216位點(diǎn)磷酸化而激活有關(guān)，然而該推測需要實(shí)驗(yàn)證據(jù)加以證實(shí)。

在本研究中，以Aβ1-40孵育SH-SY5Y細(xì)胞成功建立細(xì)胞損傷模型，表現(xiàn)為細(xì)胞培養(yǎng)上清液的LDH水平上升，伴隨細(xì)胞凋亡與壞死率均顯著增加。5 nmol/L的烏頭堿并未表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，以其預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞則可以顯著減輕Aβ1-40導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，細(xì)胞損傷釋放的LDH顯著減少，細(xì)胞凋亡與壞死率均顯著降低，與此同時(shí)細(xì)胞的Tyr216位點(diǎn)GSK-3β磷酸化水平顯著降低，提示該濃度下烏頭堿的細(xì)胞安全性是可接受的，并增強(qiáng)細(xì)胞抵抗Aβ細(xì)胞毒作用的能力，而且此作用可能與其抑制GSK-3β在Tyr216位點(diǎn)的磷酸化而激活有關(guān)。

一般認(rèn)為，烏頭堿具有心臟毒性，因此以凈水浸泡、膽巴炮制、反復(fù)蒸煮等方法減少附子中的烏頭堿，通過久煎的方法促進(jìn)烏頭堿水解，然而仍然有微量的烏頭堿進(jìn)入人體，并產(chǎn)生相應(yīng)的藥理效應(yīng)[18-20]。關(guān)于烏頭堿通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制，有研究報(bào)道，一種質(zhì)子偶聯(lián)的有機(jī)陽離子反向載體參與烏頭生物堿的血腦屏障運(yùn)輸[21]。本研究的結(jié)果表明，即使在5 nmol/L的極低濃度水平，烏頭堿仍然可以發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，顯著增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞抵御Aβ的細(xì)胞毒性損傷，提示重用附子的溫陽化瘀中藥復(fù)方治療AD的藥效與烏頭堿增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞抵抗Aβ的細(xì)胞毒作用密切相關(guān)。鑒于烏頭堿的固有心臟毒性，顯然需要設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)捏w內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，在不會(huì)造成心臟毒性的安全性前提下，驗(yàn)證烏頭堿增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞抵御Aβ的細(xì)胞毒性損傷的體內(nèi)活性。