馮嵩崴，羅山暉，王露玉，季晨晨，朱維培

215000 江蘇 蘇州，蘇州大學附屬第二醫(yī)院 婦產科(馮嵩崴、羅山暉、王露玉、朱維培);215000 江蘇 蘇州，蘇州大學 骨科研究所(季晨晨)

在女性生殖器惡性腫瘤當中，卵巢癌的總死亡率排在首位，并且5年生存率僅為25%～30%[1]。絕大多數(shù)患者在早期沒有癥狀，在確診時已經處于晚期并伴轉移。因此，探索卵巢癌新的診斷和治療方法，對卵巢癌的治療具有重大意義。

KIF4A為驅動蛋白超家族成員之一，這些蛋白在細胞內微管轉運和細胞分裂中起關鍵作用[2]。KIF4A位于細胞質和細胞核中，被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[3]。KIF4A基因在腫瘤中有著不同的作用，它在大多數(shù)腫瘤中作為原癌基因，如膠質母細胞瘤[4]、肝癌[5]和胰腺癌[6]。有趣的是，KIF4A在胃癌中起著抑癌基因的作用[7]。近來的生物信息學研究表明，KIF4A的表達在正常卵巢和腫瘤樣本中存在顯著差異，提示KIF4A可能與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關[8]。然而，KIF4A在卵巢癌中的潛在分子機制及基因功能研究尚未見相關報道。

本研究通過生物信息學方法對KIF4A在卵巢癌中進行基因其富集分析，并進一步在高表達KIF4A的卵巢癌細胞系中沉默KIF4A基因，觀察其對于腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡、周期分布等生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

細胞系A2780、HO-8910PM、COC1、SKOV3和IOSE80購自中國科學院上海細胞生物所細胞庫；培養(yǎng)基RPMI 1640、胎牛血清、PBS、胰酶購自Hyclone公司；慢病毒干擾載體sh-NC、sh-KIF4A-1、sh-KIF4A-2、sh-KIF4A-3購自GenePharma公司；實時熒光定量PCR相關試劑盒購自TaKaRa公司；lipofectamineTM2000、TRIzol及相關引物購自Invitrogen公司；兔抗人KIF4 (ab122227)及鼠抗人GAPDH (ab8245)均購自Abcam公司；Transwell小室購自Corining公司；MTT試劑盒，BCA試劑盒，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自Sigma公司；凋亡試劑及細胞周期試劑盒購自杭州聯(lián)科。

1.2 生物信息學分析

下載TCGA數(shù)據庫(http://portal.gdc.cancer.gov)中327例卵巢癌患者的轉錄組數(shù)據，以中KIF4A表達量的中位值，將樣本分為KIF4A高表達和低表達兩個亞組，設置篩選條件為logFC>0.5,P<0.05，篩選出高低亞組中上調及下調最明顯的前20個基因進行基因表達熱圖和基因相關性分析熱圖的繪制，然后將這些相關基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。使用GEPIA數(shù)據庫(http://gepia.cancer-pku.cn)檢測卵巢癌及正常卵巢上皮組織中KIF4A的表達水平及FIGO分期情況。使用KM-plotter數(shù)據庫(http://www.kmplot.com/)檢測KIF4A表達量與卵巢癌患者總生存期(overall survival, OS)的關系，并顯示P值，HR(95%CI)和生存曲線。以上數(shù)據庫所有臨床數(shù)據及轉錄組數(shù)據均基于TCGA數(shù)據庫中的卵巢癌數(shù)據。使用人類蛋白質圖譜數(shù)據庫(HPA, http://www.proteinatlas.org)檢測KIF4A基因在正常卵巢上皮及卵巢癌上皮組織的免疫組化染色情況。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染

將細胞株接種于含有FBS(10%)和青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，均在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，當匯合度達90%時進行傳代培養(yǎng)。轉染前，用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，采用攜帶sh-NC、sh-KIF4A-1、sh-KIF4A-2、sh-KIF4A-3的慢病毒對KIF4A相對表達量最多的細胞株進行轉染。

1.4 RT-qPCR及Western Blot

在RT-qPCR實驗中，應用Trizol試劑從細胞中提取總RNA，應用PrimeScript RT試劑盒進行逆轉錄，SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒用于RT-qPCR，采用熒光定量PCR儀進行擴增，反應條件為95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s反復40個循環(huán)。以GADP為內參基因，通過2-ΔΔCt方法計算結果并繪制直方圖。使用的引物序列是：KIF4A-F: 5’-TGAACTCCCAGTCGTCC-3’；KIF4A-R: 5’-GCACTGATTACATTTCCC-3’;GAPDH-F: 5’-GGAGCGAG-ATCCCTCCAAAT-3’; GADPH-R: 5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。在Western Blot實驗中，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，在SDS-PAGE膠的孔空中上樣，電泳后轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2小時。然后將兔抗人KIF4A抗體(稀釋1∶1 000)和GAPDH鼠抗人抗體(1∶2 500)加入，并在4℃下孵育過夜。使用PBST緩沖液洗膜，隨后將二抗加入并在室溫下孵育1小時，用PBST緩沖液洗滌后曝光顯影。

1.5 細胞增殖實驗(MTT法)和克隆形成實驗

在MTT實驗中，細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入10 μL MTT(5 mg/mL)試劑，在37℃下孵育4小時，加入150 μL DMSO后震蕩10 min，用酶標儀在490 nm的吸光度下進行測量，用于分析細胞增殖情況。在克隆形成實驗中，胰蛋白酶消化細胞后接種于6孔板中培養(yǎng)3周，PBS 洗滌，4%多聚甲醛室溫下固定細胞0.5 h。棄去固定液后結晶紫染色液染色10 min，最后得到集落數(shù)。

1.6 細胞遷移實驗(Transwell及劃痕實驗)

在Transwell小室遷移實驗中，下室加600 μL含10%FBS的培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期得細胞，用無血清的培養(yǎng)基進行重懸后取3×105/mL的懸液加入上室。培養(yǎng)48 h，用棉簽擦去上室中的細胞后，使用4%的多聚甲醛將小室底部細胞固定15 min，結晶紫避光染色15 min，最后在光學顯微鏡下觀察計數(shù)，隨機選取五個視野進行細胞計數(shù)。在劃痕實驗中，PBS沖洗懸浮細胞并將細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，用200 μL無菌移液槍頭筆直的產生劃痕傷口。劃痕后0小時和24小時使用顯微鏡拍攝匯合情況。

1.7 細胞凋亡及細胞周期檢測

將轉染后的卵巢癌細胞1×105個/孔接種于6孔板，37℃培養(yǎng)3天進行PBS洗滌，洗滌后用不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的胰蛋白酶進行消化，重懸于PBS然后離心收集，重復3次。凋亡：每管細胞加入5 μL FITC annexin V和Propidium Iodide Staining Solution避光孵育30分鐘，至流式細胞儀中檢測。周期：酒精固定后，10 μL破膜劑及1 mL PI(50 μL/mL)加入每管細胞后混勻，避光孵育60分鐘，至流式細胞儀中檢測。

1.8 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據用均數(shù)±標準差表示。兩組間數(shù)據比較采用t檢驗；多組間計量比較采用單因素方差分析。使用Graphpad Prism 5.0繪制所有直方圖和線圖。實驗部分統(tǒng)計均在Graphpad Prism 5.0及SPSS 16.0軟件中進行，轉錄組數(shù)據在R 3.6.1中進行統(tǒng)計分析及繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 KIF4A在卵巢癌中的基因富集分析

為了解KIF4A在卵巢癌中的調控機制及相關基因，基于TCGA數(shù)據庫中轉錄組數(shù)據，篩選出高低亞組中上調及下調最明顯的前20個基因進行表達熱圖和相關性分析熱圖的繪制(圖1A)。其中基因富集分析顯示KIF4A與MYH11、ACTG2、HSPB6等基因成負相關，與BUB1、CCNA2、MELK等基因呈正相關(圖1B)。接下來將這些共表達基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。結果表明，KIF4A在卵巢癌中具有有絲細胞核分裂，有絲分裂姐妹染色單體分離，細胞器裂變的功能。KEGG通路富集結果顯示，KIF4A可能影響細胞周期，細胞黏附分子，血管平滑肌收縮等通路(圖1C、D)。

2.2 KIF4A在卵巢癌中的表達情況

在不同細胞系中分別檢測KIF4A的表達。RT-qPCR的結果表明，與正常卵巢上皮細胞IOSE80相比，卵巢癌細胞株A2780(5.532±0.263)，SKOV3(6.565±0.224)，HO-8910PM(4.868±0.311)，COC1(5.486±0.458)中KIF4A的表達量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2A)；western blot結果顯示，卵巢癌細胞與正常卵巢上皮細胞相比，KIF4A的蛋白表達水平顯著增加，其差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2B)；因此，本研究選取KIF4A表達相對最高的SKOV3細胞進行后續(xù)試驗。與此同時，GEPIA數(shù)據庫中分析KIF4A在卵巢癌患者中的表達情況，KIF4A基因在腫瘤組中同樣高表達(P<0.01)；HPA數(shù)據庫中檢索KIF4A基因在卵巢癌上皮細胞及正常卵巢上皮細胞的免疫組織化學法染色情況，結果顯示卵巢癌上皮細胞中染色程度更強。

研究結果表明，KIF4A在卵巢癌細胞系及臨床樣本中較正常組織相比，mRNA及蛋白質表達水平均明顯升高。

圖1 KIF4A在卵巢癌中的基因富集分析

圖2 KIF4A在卵巢癌中的表達情況

2.3 KIF4A與卵巢癌患者預后的關系

在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據庫中查詢KIF4A基因表達情況與卵巢癌患者生存時間的關系，發(fā)現(xiàn)KIF4A高表達組具有較短的總生存期(HR=1.570，P<0.01)，見圖3A。在GEPIA數(shù)據庫中查詢KIF4A

基因表達量與FIGO分期的關系，結果顯示KIF4A表達量在不同分期之間具有統(tǒng)計學差異(F=3.860，P<0.05)，見圖3B。

研究結果表明，卵巢癌KIF4A高表達患者中與低表達患者相比，具有更差的預后，但卵巢癌患者中KIF4A的表達量隨著臨床分期的增高而減少。

圖3 KIF4A與卵巢癌患者預后的關系

2.4 KIF4A對卵巢癌細胞生長的影響

三組sh-KIF4A分別轉染SKOV3細胞系，結果顯示KIF4A的mRNA和蛋白均表達明顯下降(P<0.05)，選擇其中沉默效率最佳的sh-KIF4A-3進行后續(xù)實驗，見圖4。MTT法測定結果顯示，轉染24 h、48 h和72 h后，sh-KIF4A組OD值(0.239±0.020、0.735±0.056、1.611±0.001)顯著低于sh-NC組(0.602±0.023、1.632±0.025、2.718±0.048)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5A)。克隆形成實驗檢測結果顯示，sh-NC 組和 sh-KIF4A組細胞克隆形成數(shù)分別為(305±27)個和(142±12)個，差異有統(tǒng)計學意義(圖5B)。

研究結果表明，sh-KIF4A-3的沉默效果最好，且沉默KIF4A可明顯抑制卵巢癌細胞的生長。

圖4 不同sh-KIF4A的轉染效果

2.5 KIF4A對卵巢癌細胞遷移的影響

Transwell小室遷移實驗研究KIF4A對遷移的影響，結果顯示沉默KIF4A的可以抑制卵巢癌細胞的遷移，sh-KIF4A(32.3±4.6)組中穿過小室濾過膜的細胞數(shù)明顯少于sh-NC組(56.3±3.8)，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01) (圖6A)。同時劃痕實驗同樣證實了這一結論(圖6B)。

研究結果表明，Transwell及劃痕試驗均證明了沉默KIF4A可明顯抑制卵巢癌細胞的遷移能力。

圖5 沉默KIF4A對卵巢癌細胞增殖的影響

圖6 沉默KIF4A對卵巢癌細胞遷移的影響

2.6 KIF4A對卵巢癌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，sh-KIF4A組與sh-NC組的細胞凋亡率分別為5.832%±0.916%和0.247%±0.017%，sh-KIF4A組凋亡率顯著大于sh-NC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖7)。

研究結果表明，沉默KIF4A可明顯促進卵巢癌細胞的凋亡。

2.7 KIF4A對卵巢癌細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，sh-NC組與sh-KIF4A組的細胞周期分布比例 G0/G1期分別為68.124%±0.533%和50.567%±0.753%；S 期分別為30.110%±1.235%和38.443%±1.147%；G2/M 期為別為12.997%±0.012%和12.843%±0.008%。除G2/M 期外，其余周期分布比例差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖8)。說明沉默KIF4A可影響卵巢癌細胞各周期分布比例，主要影響 G0/G1 期。

研究結果表明，沉默KIF4A可將卵巢癌細胞生長阻滯于S期并主要影響 G0/G1 期的分布。

3 討 論

卵巢惡性腫瘤在女性生殖器官腫瘤中預后最差，且相應生物學功能是影響卵巢癌死亡率的重要原因。而靶向治療開創(chuàng)了卵巢癌治療的新領域，尋找作用于新靶點的藥物是近年來研究的熱點。故本研究著重探討KIF4A對腫瘤細胞生物學功能的影響及相關基因富集分析，這將為卵巢癌的診斷和治療提供重要指導。

KIF4A是驅動蛋白家族的成員之一，該家族可利用ATP水解所釋放的能量沿著微管進行包括囊泡、細胞器、染色體、蛋白質復合物和mRNA等的轉運。目前該蛋白分子在多種腫瘤中被深入研究，Taniwaki等[9]研究發(fā)現(xiàn)干擾KIF4A在肺癌細胞中的表達后，肺癌細胞的生長及侵襲受會受到抑制，提示KIF4A與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關。Liu等[10]通過體內體外實驗同樣證實KIF4A可促進腎透明細胞癌的轉移及增殖。Gao等[11]發(fā)現(xiàn)KIF4A可調節(jié)p21啟動子促進胰腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲，但是對其細胞凋亡沒有影響。雖然上述研究提示KIF4A異常表達與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關，相關生物信息學研究也表明KIF4A與卵巢癌患者的預后顯著相關，但目前仍缺乏KIF4A與卵巢癌的生物學功能試驗研究。因此，本研究進一步分析KIF4A在卵巢癌中的預后、生物學功能及相關基因富集分析，以期對卵巢癌的靶向治療提供新思路。

本研究首先通過生物信息學方法，在卵巢癌患者公共數(shù)據庫中檢索KIF4A基因與卵巢癌患者總生存期及FIGO分期的關系，結果顯示高表達KIF4A生存時間明顯降低，這與陳柱等[12]和胡國輝等[13]在乳腺癌及肝癌患者的預后分析中結果相一致，這提示KIF4A可能在泛癌中均與預后有著明顯聯(lián)系。但卵巢癌患者中KIF4A的表達量卻不隨著腫瘤臨床分期的嚴重程度所增加，這與之前其他腫瘤中的研究[14]結果不一致，這需要將來進一步研究。接下來RT-qPCR檢測了人卵巢癌正常上皮細胞株IOSE80和多種卵巢癌細胞株和中KIF4AmRNA 的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞A2780，HO-8910PM，COC1，SKOV3中KIF4AmRNA 的表達水平顯著高于正常卵巢上皮細胞。選取其中KIF4A表達水平最高的細胞株SKOV3進行了后續(xù)功能試驗。結果發(fā)現(xiàn)，沉默KIF4A的表達可抑制卵巢癌細胞的生長及遷移并促進其凋亡。此外，沉默KIF4A影響卵巢癌的周期分布，主要影響G0/G1期，并使細胞阻滯在S期，進而導致腫瘤的生長抑制。關于KIF4A在分子層面的深入機制已有相關報道。研究發(fā)現(xiàn)KIF4A調控肝癌細胞的生長可能是通過調節(jié)巨噬細胞血管生成相關因子[15]，但具體機制仍需進一步闡明。武巖[16]研究發(fā)現(xiàn)NLP蛋白可與KIF4A蛋白一起參與調控中間小體的生成參與正常及腫瘤細胞的有絲分裂。在乳腺癌中，KIF4A可被多柔比星誘導低表達并影響PARP-1的上調[17]，且miR-335可對其進行調控，并通過熒光素酶試驗進行了驗證[18]。但是KIF4A在卵巢癌中的深層機制的研究還未有報道，這將來值得進一步的深入探討。

KIF4A作為驅動蛋白家族的成員之一，驅動蛋白抑制劑能夠克服抗微管類藥物的耐藥，如有絲分裂驅動蛋白KIF20B[19]及Eg5[20]抑制劑具有抗增殖作用已被證實可用于肝癌及其他惡性腫瘤的治療。根據KIF4A在有絲分裂過程中的作用，選擇性地抑制 KIF4A的活性，進而抑制腫瘤細胞的生長及分裂,這有可能成為新的卵巢癌患者的治療策略。

綜上所述，我們的研究結果表明，KIF4A與卵巢癌患者的預后及細胞的生物學具有明顯相關。但是，KIF4A在卵巢癌中發(fā)生和發(fā)展的具體作用及相關機制并未完全闡明，以及相應的調節(jié)機制也需在動物模型進行進一步的研究，相信在完善相關基礎及臨床實驗后，KIF4A將有望成為卵巢癌治療的新靶點，并改善卵巢癌患者的預后。

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