黃筱鈞，鄧昭敏，王紅仁，鄺玉，李婉宜，李明遠(yuǎn)

445000湖北 恩施，湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部 病原生物學(xué)教研室(黃筱鈞)；610041成都，西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科(鄧昭敏)；610041成都，四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室(王紅仁、鄺玉、李婉宜、李明遠(yuǎn))；610041成都，四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科(李明遠(yuǎn))

2018年全球960萬(wàn)人死于腫瘤，肝癌的死亡率位居第3位[1]?，F(xiàn)有的治療方法都不能顯著延長(zhǎng)肝癌患者的生存期，其5年生存率僅18%，探尋新的治療方法迫在眉睫[2]。促進(jìn)肝癌發(fā)展，影響肝癌等實(shí)體瘤治療效果的最大因素是腫瘤局部微環(huán)境[3-4]，其中乏氧是肝癌微環(huán)境的重要特點(diǎn)。乏氧微環(huán)境是肝癌產(chǎn)生藥物抗性和化療抗性的主要原因，因此，破壞或利用乏氧微環(huán)境成為實(shí)體瘤治療的新策略。300多年前就有腫瘤患者感染后腫瘤自然消退的病例記載，但因?yàn)闊o(wú)法解釋其原理，用于治療時(shí)無(wú)法接受發(fā)熱等副反應(yīng)，且治療過(guò)程無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致細(xì)菌抗腫瘤研究一直沒(méi)有較大進(jìn)展。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究人員利用基因改造的方法去除厭氧菌的毒性基因，或?qū)捬蹙脑鞛榭鼓[瘤藥物的載體，從而克服厭氧菌自身的毒副作用和化療藥物選擇性差、瘤內(nèi)濃度低的不足，有效利用腫瘤氧含量低、血供差的微環(huán)境[5]。厭氧菌抗腫瘤隨之引起了人們極大關(guān)注。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)厭氧性細(xì)菌對(duì)實(shí)體瘤的乏氧區(qū)和壞死區(qū)具有選擇性定植的能力，表現(xiàn)出溶瘤效應(yīng)。諾維氏梭菌(Clostridiumnovyi，C.novyi)為厭氧芽胞梭菌屬的成員，廣泛分布于外界環(huán)境中，可從土壤、海洋沉淀物、人類(lèi)氣性壞疽傷口或動(dòng)物的局部感染傷口中分離得到，熱休克法可以獲得無(wú)毒諾維氏梭菌(nontoxigenicClostridiumnovyi，C.novyi-NT)[6]。裸鼠研究結(jié)果顯示，C.novyi-NT對(duì)黑色素瘤、結(jié)腸癌、腎癌、軟組織肉瘤、胰腺癌、腦瘤及惡性膠質(zhì)瘤均表現(xiàn)出抑制作用，I期臨床試驗(yàn)證實(shí)C.novyi-NT對(duì)人體腫瘤也有抑制作用[7-11]。目前尚沒(méi)有單用C.novyi-NT抗免疫正常小鼠肝癌的報(bào)道。本研究選擇最常用、易操作、易觀察的方法建立BALB/c小鼠H22皮下移植瘤模型，采用瘤內(nèi)注射C.novyi-NT方式進(jìn)行干預(yù)，評(píng)估C.novyi-NT對(duì)小鼠移植性肝癌的抑瘤效應(yīng)，及其在腫瘤和重要器官的定植情況，確定瘤內(nèi)注射的最佳劑量，并觀察細(xì)菌干預(yù)后荷瘤鼠炎癥反應(yīng)、抗腫瘤免疫及腫瘤轉(zhuǎn)移情況，為后續(xù)探索C.novyi-NT抗肝癌的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)菌和細(xì)胞

SPF級(jí)BALB/c小鼠，雄性，體重(18±2)g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(許可證號(hào)：SCXK(川) 2013-24)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有操作取得了四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)IACUC-20140010)。C.novyi為ATCC 19402株，熱休克法去毒[6]，獲得C.novyi-NT。肝癌H22細(xì)胞株由四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室保存。

1.2 主要試劑

哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(OXOID)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP302)、組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP304)、改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(Hycone，NAD1385)，胎牛血清(Gibco，1551835)、2000bp DNA Marker(Takara，DL2000),2×Taq Master Mix(Novoprotein，E005)。

1.3 主要儀器

光學(xué)顯微鏡(Leica，DM750)、紫外分光光度計(jì)(K.O，K5600)、PCR儀(BIOER)、電泳儀(BIO-RAD)、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)、厭氧罐(重慶艾奇醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 主要方法

1.4.1 建立小鼠皮下移植瘤模型 收集BALB /c小鼠H22腹水，用生理鹽水洗滌、離心，收集沉淀細(xì)胞，稀釋為1.0×107/mL。無(wú)菌環(huán)境下，每只小鼠左前肢皮下注射0.2 mL H22細(xì)胞懸液。待腫瘤肉眼可見(jiàn)后每周2次用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積。V=a×b2×1/2(V為腫瘤體積，a為腫瘤的最長(zhǎng)徑，b為腫瘤的最短徑)

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 按照腫瘤建模要求(腫瘤平均重量≥1 g或20%腫瘤重量≥400 mg)衡量，32只BALB/c小鼠均造模成功。于第10天稱(chēng)量小鼠重量，測(cè)量腫瘤大小，隨機(jī)分為對(duì)照組、C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組8只。對(duì)照組瘤內(nèi)注射0.5 mL生理鹽水、低劑量組瘤內(nèi)注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×107/mL)、中劑量組瘤內(nèi)注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×108/mL)、高劑量組瘤內(nèi)注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×109/mL)。每天觀察小鼠的一般情況，每周3次定時(shí)稱(chēng)小鼠重量，每周2次測(cè)腫瘤大小，繪制小鼠重量變化、腫瘤體積變化曲線，比較組間差異。

1.4.3 采集標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)干預(yù)后第12天處死全部小鼠，剝離腫瘤、肝、肺、脾、腦、腎、脾臟、胸腺，腫瘤拍照記錄，稱(chēng)腫瘤重量、脾臟和胸腺質(zhì)量，用于HE染色的組織置4%多聚甲醛固定，其余組織置-80 ℃保存。計(jì)算抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。抑瘤率=(細(xì)菌干預(yù)組瘤重-生理鹽水組瘤重)/細(xì)菌干預(yù)組瘤重×100%；脾臟(胸腺)指數(shù)(mg/10g)=脾臟(胸腺)質(zhì)量mg/(小鼠重量g×10)。

1.4.4 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定 取剝離的一部分腫瘤、肝、脾、肺、腎、腦組織直接涂片后行革蘭染色，一部分涂布接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)菌情況。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟提取組織DNA，根據(jù)GenBank中查得的C.novyi-NT序列(Gene ID: CP000382.1) ，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成引物(上游引物：5′-TGCCCCTTATGTCTAGGGCT -3′,下游引物：5′-CGACTTCACCCCAATCACCA -3′)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為292 bp。用提取的C.novyiDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)變性 95℃ 5 min，變性 95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸 72℃ 20 s，30個(gè)循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4.5 腫瘤和主要臟器組織HE染色 將固定24 h的組織取出，梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞、組織壞死及炎癥反應(yīng)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 荷瘤鼠干預(yù)后一般情況、體重變化

干預(yù)第2天高劑量組小鼠腫瘤部位均可觀察到小紅點(diǎn)，其他組無(wú)明顯變化，隨后實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤部位出現(xiàn)紅腫、壞死。小鼠活動(dòng)量減少，精神一般，飲食、飲水量減少。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，局部炎癥反應(yīng)減輕，部分腫瘤縮小。小鼠重量變化為:生理鹽水組小鼠的重量持續(xù)增加；低劑量組小鼠重量前3天變化不大，隨后持續(xù)增加；中劑量組小鼠重量前8天呈增加趨勢(shì)，且第3～8天變化較大，第8～12天變化不明顯；高劑量組小鼠重量前3天呈下降趨勢(shì)，隨后開(kāi)始快速增加。小鼠干預(yù)前和處死后體重情況見(jiàn)表1，高劑量組小鼠體重與生理鹽水組、中劑量組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033，P=0.001)；低劑量組小鼠體重與中劑量組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)。小鼠體重結(jié)果分析顯示，中劑量組8只小鼠中有5只體重明顯大于其他組。

表1 各實(shí)驗(yàn)組荷瘤小鼠體重變化

2.2 腫瘤重量、體積及抑瘤率

剝離腫瘤時(shí)可見(jiàn)生理鹽水組腫瘤較大，顏色較鮮艷，有較多紅色液體，黏連嚴(yán)重。與生理鹽水組比較，中劑量組腫瘤顏色較淺，壞死區(qū)較大，炎性滲出物多，部分腫瘤包膜完整，與周?chē)M織黏連較輕；高劑量組腫瘤壞死區(qū)大，豆腐渣樣組織較多，有臭味，黏連嚴(yán)重。腫瘤體積結(jié)果顯示，中劑量組腫瘤體積第3～8天呈增加趨勢(shì)，且增加速度快，第8～12天變化較??；其他各組腫瘤體積持續(xù)增加，第3天后增加更快。腫瘤重量結(jié)果顯示，中劑量組約50 %的腫瘤重量比其他組小。中劑量組腫瘤重量與生理鹽水組、低劑量組和高劑量組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006，P=0.015，P=0.041)。根據(jù)抑瘤率計(jì)算公式計(jì)算可得C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組的抑瘤率分別為8.49%、44.59%和14.84%(表2)。

表2 各實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量、體積及抑瘤率(N=8)

2.3 腫瘤和主要臟器細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定

剝離的腫瘤及臟器組織涂片后行革蘭染色，腫瘤組織標(biāo)本油鏡下可見(jiàn)大量棒狀或桿狀細(xì)菌，被染成紫色，其他組織標(biāo)本未觀察到C.novyi。腫瘤及臟器組織細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，接種腫瘤組織的平板內(nèi)見(jiàn)可疑C.novyi菌落外，高劑量組肝組織標(biāo)本見(jiàn)可疑C.novyi，其他組織標(biāo)本均未見(jiàn)C.novyi菌落。菌落行革蘭染色，油鏡觀察顯示腫瘤組織標(biāo)本有大量C.novyi，高劑量組肝臟標(biāo)本有少許可疑C.novyi。提取各組織DNA，測(cè)定DNA濃度后，再經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示除腫瘤組織標(biāo)本有陽(yáng)性條帶外其余均無(wú)陽(yáng)性條帶。

2.4 腫瘤和主要臟器組織HE染色

小鼠皮下腫瘤組織行HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，大小不一，核深染，核大小、形態(tài)、染色不一，核漿比例增大。生理鹽水組未見(jiàn)明顯組織壞死；C.novyi-NT組均可見(jiàn)組織壞死，中劑量組壞死組織呈粉染、不規(guī)則顆粒狀，邊界不規(guī)則，邊緣見(jiàn)慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；高劑量組壞死組織伴少量慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)和出血(圖1)。肝、肺、腎組織HE染色均未見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。

2.5 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

完整剝離脾臟和胸腺，肉眼可見(jiàn)部分小鼠的脾臟明顯增大。生理鹽水組、C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組脾臟平均質(zhì)量依次增大，分別為(0.284±0.076)g、(0.383±0.108)g、(0.441±0.177)g和(0.636±0.137)g，中劑量組、高劑量組與生理鹽水組脾臟質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022，P<0.001)，高劑量組、中劑量組和低劑量組脾臟質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004，P=0.017)。生理鹽水組、低劑量組、中劑量組和高劑量組脾臟指數(shù)分別為(0.954±0.266)、(1.230±0.359)、(1.463±0.596)和(2.183±0.405)，高劑量組脾臟指數(shù)明顯大于其他組，與生理鹽水組、低劑量組、中劑量組脾臟指數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P=0.001，P=0.003)，中劑量組與生理鹽水組脾臟指數(shù)比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。C.novyi-NT中劑量組胸腺平均質(zhì)量最大，生理鹽水組、C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組胸腺質(zhì)量分別為(0.162±0.034)g、(0.147±0.019)g、(0.167±0.028)g和(0.118±0.017)g，高劑量組胸腺平均重量最小，與生理鹽水組和中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004，P=0.001)。生理鹽水組、C.novyi-NT低劑量組、中劑量組和高劑量組胸腺指數(shù)分別為(0.520±0.118)、(0.500±0.101)、(0.566±0.093)和(0.422±0.008)，各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織HE染色(×200)

3 討 論

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的五大惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤第二位[12]。我國(guó)每年新發(fā)肝癌病例數(shù)占全球總數(shù)的50%左右，肝癌已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和制約社會(huì)發(fā)展的重大問(wèn)題[13]。手術(shù)、化學(xué)藥物治療、放射治療、射頻消融等仍是肝癌治療的主要手段，但都不能顯著延長(zhǎng)患者的生存周期[14]。肝癌的既往研究主要集中在癌細(xì)胞本身，包括癌細(xì)胞基因和抑癌基因的改變、分化程度和表型的改變等。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)肝癌的微環(huán)境在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中同樣起著非常重要的作用[15-18]。氧含量低、血供差是肝癌微環(huán)境的普遍特征。藥物需要隨血液到達(dá)作用部位，且要達(dá)到一定的濃度才能發(fā)揮殺腫瘤細(xì)胞的作用，放射線也需要氧發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[19]。氧含量低、血供差的特殊微環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移，而限制了傳統(tǒng)的腫瘤化學(xué)藥物和放射治療方法[20]。研究者們開(kāi)始思考，能否破壞或有效地利用此特殊的微環(huán)境呢？1813 年，Vautier觀察到腫瘤患者感染氣性壞疽后，腫瘤生長(zhǎng)減緩甚至消退，這一現(xiàn)象引起了人們對(duì)細(xì)菌抗腫瘤的關(guān)注。Coley等[21]做出了積極的探索，卡介苗已成功用于臨床治療淺表性膀胱癌。2001年，Dang等[7]從26株細(xì)菌中篩選出野生型C.novyi具有高度腫瘤靶向定植能力，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)C.novyi-NT具有強(qiáng)大的溶瘤效應(yīng)。

既往研究中，有研究者選擇了C.novyi-NT靜脈注射[7-9,11,22]，另有研究者則選擇了瘤內(nèi)注射[7,10]。靜脈注射容易產(chǎn)生全身反應(yīng)(25%～30%)，到達(dá)腫瘤部位的細(xì)菌太少[9]。同時(shí)，部分細(xì)菌在血液中丟失或死亡，無(wú)法有效發(fā)揮抗腫瘤作用，而瘤內(nèi)直接注射就解決了此問(wèn)題。此外，瘤內(nèi)注射比傳統(tǒng)的局部治療(如手術(shù)、放療)更簡(jiǎn)單，易操作。瘤內(nèi)注射C.novyi-NT還能引起局部炎癥反應(yīng)和抗腫瘤免疫反應(yīng)[9]。所以，本研究選擇的是瘤內(nèi)注射途徑。

肝癌是消耗性疾病，荷瘤小鼠重量變化可以反映小鼠自身狀況(體重)和腫瘤重量變化的最終結(jié)果。荷瘤小鼠重量變化顯示，C.novyi-NT中劑量組小鼠重量前8天呈增加趨勢(shì)，隨后小鼠重量變化不大，可能是細(xì)菌定植后，發(fā)揮溶瘤作用，腫瘤生長(zhǎng)受抑制或變緩，小鼠體重降低減慢的結(jié)果。而高劑量組小鼠重量前3天呈下降趨勢(shì)，隨后持續(xù)快速增加，可能是因?yàn)镃.novyi-NT劑量太大，發(fā)揮溶瘤作用迅速，產(chǎn)生的大量代謝產(chǎn)物及導(dǎo)致的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)對(duì)小鼠產(chǎn)生不良影響，此變化趨勢(shì)與小鼠一般情況(高劑量組最差)和腫瘤局部變化一致。小鼠體重結(jié)果顯示，高劑量組顯著低于生理鹽水組和中劑量組。腫瘤大范圍較快地溶解，易引起嚴(yán)重的毒血癥，出現(xiàn)腫瘤溶解綜合征，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡[5]。這可能是高劑量組小鼠一般情況差的原因。

按照抗腫瘤藥物藥效學(xué)指導(dǎo)原則，只有當(dāng)抑制率>30%才能評(píng)定該藥物對(duì)腫瘤有一定療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中劑量組抑瘤率達(dá)44.59%，而其他組均低于30%，所以可以判定中劑量C.novyi-NT對(duì)免疫正常小鼠皮下H22移植瘤有療效。

研究C.novyi抗腫瘤效應(yīng)，細(xì)菌的轉(zhuǎn)移是不可忽視的問(wèn)題。本研究中，各組小鼠的肝、脾、肺、腎、腦組織DNA鑒定均未發(fā)現(xiàn)C.novyi定植，但高劑量組肝臟標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)和革蘭染色可見(jiàn)可疑C.novyi，分析其原因可能是操作污染所致或因劑量太大少量細(xì)菌經(jīng)血液到達(dá)肝臟，但經(jīng)肝組織細(xì)菌DNA提取后PCR檢測(cè)無(wú)C.novyi，可以判定C.novyi-NT瘤內(nèi)注射是安全的。C.novyi能選擇性地靶向定植于H22移植瘤的乏氧區(qū)，而不轉(zhuǎn)移至其他組織的可能原因有：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，而瘤內(nèi)血管形態(tài)不規(guī)則，血流紊亂，導(dǎo)致肝癌內(nèi)部缺氧，形成乏氧微環(huán)境，為C.novyi生長(zhǎng)繁殖提供了理想條件；腫瘤細(xì)胞代謝旺盛，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，為C.novyi生長(zhǎng)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，C.novyi在瘤內(nèi)比正常組織的增殖能力更強(qiáng)，更易在腫瘤內(nèi)富集；肝癌血管分布和結(jié)構(gòu)異常、腫瘤組織間隙的高壓使瘤內(nèi)免疫細(xì)胞、抗體、補(bǔ)體等數(shù)量減少，功能的發(fā)揮受到抑制，C.novyi在瘤內(nèi)較難被免疫系統(tǒng)識(shí)別、清除[5]。

免疫器官質(zhì)量的變化可作為判斷藥物對(duì)免疫系統(tǒng)影響的指標(biāo)之一。本研究分析了各組胸腺、脾臟的質(zhì)量及胸腺、脾臟指數(shù)的差異，結(jié)果顯示中劑量組脾臟質(zhì)量和指數(shù)顯著大于生理鹽水組。脾臟質(zhì)量和指數(shù)不能完全反映免疫系統(tǒng)的活化程度，但脾臟是B細(xì)胞發(fā)育、分化的場(chǎng)所，B細(xì)胞與體液免疫有關(guān)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)借助流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫細(xì)胞亞群，全面評(píng)價(jià)諾維氏梭菌瘤內(nèi)注射后對(duì)H22移植瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。

綜上所述，C.novyi-NT能選擇性地定植于肝癌乏氧區(qū)，中劑量(1.0×108/mL，0.5 mL)C.novyi-NT能有效抑制免疫正常小鼠H22皮下移植瘤。C.novyi-NT抗H22移植瘤的作用機(jī)制可能是細(xì)菌局部定植腫瘤乏氧區(qū)后，其菌體成分和代謝產(chǎn)物本身具有細(xì)胞毒性，直接對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，也可能是C.novyi誘發(fā)腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)和抗腫瘤免疫反應(yīng)間接發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[5,23]。C.novyi能在腫瘤組織中優(yōu)先增殖，與腫瘤細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)微環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)素和生長(zhǎng)因子；C.novyi分泌的蛋白水解酶、脂肪酶等破壞腫瘤細(xì)胞；細(xì)菌代謝產(chǎn)物(如磷脂酶C、脂質(zhì)體酶、毒素)破壞腫瘤微環(huán)境[24]；C.novyi菌體成分刺激白細(xì)胞增殖分化，誘發(fā)TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，從而增強(qiáng)小鼠的免疫應(yīng)答能力；C.novyi聚集于腫瘤部位，引起局部炎癥反應(yīng)，富集大量特異性與非特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞，誘導(dǎo)了與腫瘤抗原有關(guān)的交叉免疫以及抗腫瘤免疫反應(yīng)。肝癌的治療方法包括肝切除術(shù)、肝移植、經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、射頻消融、分子靶向治療等，但總體療效并不高[25]。本研究豐富了C.novyi抗腫瘤的種類(lèi)，拓展了腫瘤生物治療的新思路，為深入探討C.novyi治療肝癌奠定了重要基礎(chǔ)，后續(xù)將圍繞乏氧微環(huán)境及炎癥反應(yīng)和抗腫瘤免疫探索其可能的機(jī)制。

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