翟亞萍，王紹明，劉 鴦，楊 盼，張 霞，趙 祥，劉 丹

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】紫花苜蓿(MedicagosativaL.)種植產(chǎn)業(yè)增長(zhǎng)空間較大[1]。研究土壤微生物多樣性，群落結(jié)構(gòu)、種類組成及其功能預(yù)測(cè)，有助于闡明生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能之間的關(guān)系[2]。土壤細(xì)菌是土壤微生物中種類最多、數(shù)量最大、在土壤有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與吸收等過(guò)程中起到重要作用的類群，其群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性變化是表征土壤環(huán)境質(zhì)量的敏感指標(biāo)[3-4]。【前人研究進(jìn)展】李怡等[5]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了林地根際與非根際土壤細(xì)菌的物種組成、多樣性和群落結(jié)構(gòu)。趙祥等[6]研究表明，滴灌增加了植物根際土壤中細(xì)菌多樣性和豐度。李文廣等[7]合理復(fù)種飼料油菜并還田可提高后茬麥田土壤養(yǎng)分含量及酶活性，并有效改善細(xì)菌群落多樣性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，新疆北疆苜蓿土壤微生物研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。研究新疆北部不同種植地苜蓿土壤細(xì)菌群落多樣性及群落分布特征?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，Tax4Fun功能預(yù)測(cè)進(jìn)行功能分類，對(duì)新疆天山北麓石河子地區(qū)、塔城地區(qū)苜蓿土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析。分析細(xì)菌群落組成與土壤酶活性之間的關(guān)系，為研究新疆北部苜蓿土壤微生物的群落組成、物種多樣性及生態(tài)功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

研究區(qū)選取新疆天山北麓石河子地區(qū)、塔城地區(qū)種植苜蓿地，屬于溫帶干旱大陸性氣候區(qū)，冬季長(zhǎng)而嚴(yán)寒，夏季短而炎熱。石河子地區(qū)年平均氣溫7～8℃，北部地區(qū)氣溫低，南部高。日照2 300～2 700 h，年均降雨量180～270 mm，年蒸發(fā)量1 000～1 500 mm。塔城地區(qū)降水量稍多，年均降雨量 290 mm，年蒸發(fā)量1 600 mm，日照2 800～3 000 h，無(wú)霜期 130～190 d。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

2018年7月在新疆石河子地區(qū)，塔城地區(qū)選取6個(gè)不同種植苜蓿地作為樣地，所取樣品分為12種土壤類型。分別在6個(gè)樣地內(nèi)設(shè)置3個(gè)5 m×5 m的樣方，每個(gè)樣方內(nèi)選取5～10株植株，根際土壤取樣采用“抖根法”，植物根系從土壤中挖出，抖掉與根系結(jié)合松散的土壤，收集與根系緊密結(jié)合在 4 mm的土壤作為根際土壤，在采集根際土旁選取沒(méi)有植物生長(zhǎng)的位置采集與根際土相同深度的土壤作為非根際土壤樣品。土壤于4℃保存并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，1份保存于-80℃，供提取土壤 DNA 進(jìn)行高通量測(cè)序；另1份風(fēng)干保存，用于基礎(chǔ)數(shù)據(jù)測(cè)定。12種土壤類型分別為紫泥泉苜蓿根際土壤(簡(jiǎn)化為ZR)，紫泥泉苜蓿非根際土壤(ZN)，147團(tuán)苜蓿根際土壤(SR)，147團(tuán)苜蓿非根際土壤(SN)，沙灣縣苜蓿根際土壤(WR)，沙灣縣苜蓿非根際土壤(WN)，額敏縣苜蓿根際土壤(ER)，額敏縣苜蓿非根際土壤(EN)，托里縣苜蓿根際土壤(TR)，托里縣苜蓿非根際土壤(TN)，裕民縣苜蓿根際土壤(XR)，裕民縣苜蓿非根際土壤(XN)。表1

表1 采樣地點(diǎn)及樣品信息

1.2.2 土壤理化性質(zhì)及酶活性

土壤理化指標(biāo)的測(cè)定參考鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》中的測(cè)定方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)，利用單端測(cè)序(Single-End)的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行單端測(cè)序，測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw Data)進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析。對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性計(jì)算等分析，得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。將高通量測(cè)序獲得的有效數(shù)據(jù)按照97%的一致性將序列聚類成為OTUs后，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)Silva132比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，并對(duì)不同分類層級(jí)統(tǒng)計(jì)。進(jìn)行組間差異的比較，揭示不同處理或環(huán)境下的群落結(jié)構(gòu)的差異特征。將高通量測(cè)序獲得的有效數(shù)據(jù)按照97%的一致性將序列聚類成為OTUs后，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)Silva132比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，并對(duì)不同分類層級(jí)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：共有7 343個(gè)OTUs，其中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs數(shù)目為7 336(99.90%)。

選取每個(gè)樣本在門分類水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖。根據(jù)12個(gè)土樣類型在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個(gè)樣本中的豐度信息，從物種和樣本兩個(gè)層面進(jìn)行聚類，繪制成熱圖。Tax4Fun功能預(yù)測(cè)根據(jù)樣品在數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能注釋及豐度信息，基于KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)從功能差異層面進(jìn)行聚類。

Tax4Fun功能預(yù)測(cè)是通過(guò)基于最小16S rRNA 序列相似度的最近鄰居法實(shí)現(xiàn)的，提取KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)原核生物全基因組16S rRNA 基因序列并利用BLASTN 算法將其比對(duì)到SILVA SSU Ref NR 數(shù)據(jù)庫(kù)(BLAST bitscore >1 500)建立相關(guān)矩陣， 通過(guò)UProC和PAUDA 2種方法注釋的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)原核生物全基因組功能信息對(duì)應(yīng)到SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中，實(shí)現(xiàn)SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋。測(cè)序樣品以SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)序列為參考序列聚類出OTU，進(jìn)而獲取功能注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤營(yíng)養(yǎng)成分

研究表明，石河子地區(qū)、塔城地區(qū)12種土壤類型均表現(xiàn)出根際土壤纖維素酶、脲酶和中性磷酸酶含量均高于非根際土壤，過(guò)氧化氫酶含量除托里縣苜蓿根際(TR)與非根際(TN)外均表現(xiàn)出根際土壤高于非根際土壤，蔗糖酶含量除額敏縣苜蓿根際(ER)與非根際(EN)外也均表現(xiàn)為根際土壤高于非根際土壤。其中除托里縣苜蓿根際(TR)與非根際(TN)過(guò)氧化氫酶含量和額敏縣苜蓿根際(ER)與非根際(EN)蔗糖酶含量外各組根際土壤與非根際土壤5種酶活性均呈現(xiàn)顯著性差異。表2

表2 不同土樣類型下土壤酶活性

2.2 樣品間 Alpha 多樣性

研究表明，對(duì)36個(gè)土壤樣品進(jìn)行高通量測(cè)序經(jīng)方法后共獲得2 581 720條高質(zhì)量序列，平均長(zhǎng)度為412 nt。各樣品文庫(kù)的覆蓋率(Coverage)均大于97.8%，各樣地的微生物物種信息得到了充分的體現(xiàn)，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)的反映出土壤細(xì)菌群落的情況。Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)表現(xiàn)為過(guò)氧化氫酶含量較高樣地(TR、SR、ER)>過(guò)氧化氫酶含量較低樣地(WR、XR、ZR)，Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)表現(xiàn)為中性磷酸酶含量較高樣地(SR、XR、ER)>中性磷酸酶含量較低樣地(WR、ZR、TR)。其中Simpson指數(shù)除額敏縣苜蓿根際(ER)與非根際(EN)外各組根際與非根際之間沒(méi)有顯著性差異，Chao1指數(shù)除紫泥泉苜蓿根際(ZR)與非根際(ZN)外各組根際與非根際之間沒(méi)有顯著性差異。表3

表3 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

2.3 土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)與土壤酶活性之間的關(guān)系

研究表明，中性磷酸酶與Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系；過(guò)氧化氫酶與Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)呈負(fù)相關(guān)；Simpson指數(shù)與纖維素酶、脲酶和中性磷酸酶呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；蔗糖酶與Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。表4

表4 土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)與土壤酶活性之間的相關(guān)性

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

研究表明，共有 7,343個(gè)OTUs，其中，能夠注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)的OTUs數(shù)目為7,336(99.90%)，注釋到界水平的比例為99.90%，門水平的比例為91.47%，綱水平的比例為79.12%，目水平的比例為66.27%，科水平的比例為52.62%，屬水平的比例為33.45%，種水平的比例為7.42%。

在門水平上，所測(cè)12個(gè)土樣類型的序列共分屬于51個(gè)門，共同擁有的有22個(gè)門，排名前10的分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門 (Euryarchaeota) 、浮霉菌門 (Planctomycetes)和 厚壁菌門 (Firmicutes) 。門分類水平上，12個(gè)土樣類型細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)大致相同，優(yōu)勢(shì)種群相似但豐度略不相同。圖1

圖1 不同土樣類型下細(xì)菌在門分類水平上的群落結(jié)構(gòu)

研究表明，在屬分類水平上，測(cè)得12個(gè)土樣類型的序列共分屬于600個(gè)屬；其中12個(gè)土樣類型共同擁有的有190個(gè)屬，在群落中占比例較高的有10個(gè)屬，分別寡養(yǎng)單胞菌屬 (Stenotrophomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas) 、芽球菌屬( Blastococcus) 、節(jié)桿菌屬 (Arthrobacter) 、紅色桿菌屬(Rubrobacter)、unidentified_Acidobacteria、unidentified_Actinomarinales、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、Gaiella、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)。圖2

圖2 不同土樣類型下細(xì)菌在屬分類水平上的群落結(jié)構(gòu)

聚類主要集中在變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和擬桿菌門(Bacteroidetes)6個(gè)門類中。各樣地根際與非根際相比：紫泥泉苜蓿根際(ZR)提高了Gaiella、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)、紅色桿菌屬(Rubrobacter)、Pelagibius的豐度；147團(tuán)苜蓿根際(SR)的優(yōu)勢(shì)菌屬為藤黃單胞菌屬(Luteimonassp)、Pelagibius；沙灣縣苜蓿根際(WR)提高了Polycyclovorans的豐度；額敏縣苜蓿根際(ER)的優(yōu)勢(shì)菌屬為寡養(yǎng)單胞菌屬 (Stenotrophomonas) 、節(jié)桿菌屬 (Arthrobacter) ；托里縣苜蓿根際(TR)的優(yōu)勢(shì)菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Stenotrophobacter、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)；裕民縣苜蓿根際(XR)提高了紅游動(dòng)菌屬 (Rhodoplanes)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)豐度。圖3

圖3 不同土樣類型下細(xì)菌在屬分類水平上的熱聚類

2.5 土壤細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)

研究表明，紫泥泉苜蓿根際(ZR)中遺傳信息處理(Genetic_Information_Processing)、有機(jī)體系統(tǒng)(Organismal_Systems)功能豐度較高；147團(tuán)苜蓿根際(SR)豐度較高的功能預(yù)測(cè)為新陳代謝(Metabolism)、未分類(Unclassified)、人類疾病(Human_Diseases)；沙灣縣苜蓿根際(WR)環(huán)境信息處理(Environmental_Information_Processing)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular_Processes)、未分類(Unclassified)、人類疾病(Human_Diseases)；額敏縣苜蓿根際(ER)中細(xì)胞過(guò)程(Cellular_Processes)、人類疾病(Human_Diseases)功能豐度較高；托里縣苜蓿根際(TR)環(huán)境信息處理(Environmental_Information_Processing)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular_Processes)、人類疾病(Human_Diseases)的豐度提高；裕民縣苜蓿根際(XR)比非根際(XN)新陳代謝(Metabolism)、未分類(Unclassified)的功能豐度提升。圖4

圖4 不同土樣類型細(xì)菌功能預(yù)測(cè)熱聚類

3 討 論

研究表明，種植苜蓿能夠明顯提高土壤酶活性，而土壤酶活性是影響土壤中微生物群落組成的因素之一[8]。土壤脲酶能夠提高土壤氮素的生物有效性；土壤蔗糖酶參與蔗糖降解；土壤中性磷酸酶催化有機(jī)磷水解, 供植物吸收；土壤過(guò)氧化氫酶可以分解土壤中對(duì)植物有害的自由基—過(guò)氧化氫；纖維素酶可以分解纖維素和木質(zhì)素。研究細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù)和Ace指數(shù))與土壤中性磷酸酶呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明細(xì)菌能夠提高土壤中性磷酸酶含量并且促進(jìn)根際土壤磷養(yǎng)分的累積，而土壤中性磷酸酶的提升能夠增加細(xì)菌群落多樣性。石河子地區(qū)、塔城地區(qū)苜蓿根際土壤有著豐富的微生物資源，通過(guò)對(duì)樣品間 Alpha 多樣性分析可知，石河子地區(qū)3個(gè)樣地相較于塔城地區(qū)3個(gè)樣地細(xì)菌群落多樣性較高，但是豐富度較低。石河子地區(qū)鹽堿化程度嚴(yán)重及土地熟化程度不及塔城地區(qū)，細(xì)菌種類總數(shù)較低，不同環(huán)境條件下石河子地區(qū)、塔城地區(qū)苜蓿根際土壤的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群不盡相同。

在不同的12個(gè)土壤樣本中，豐度最高的為變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，這與前人研究結(jié)果一致[3]。其中放線菌門、變形菌門中的部分微生物參與土壤有機(jī)質(zhì)礦化, 具有分解纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等功能[9]，這證實(shí)了研究中土壤纖維素酶、土壤蔗糖酶與細(xì)菌群落多樣性指數(shù)呈正相關(guān)。中性磷酸酶含量較高的樣地(SR、XR、ER)中豐度較高的為藤黃單胞菌屬(Luteimonassp) 為近年來(lái)的新發(fā)現(xiàn)屬，且尚未有其可產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的報(bào)道[10]；Pelagibius為嗜鹽細(xì)菌，能夠適應(yīng)鹽化生境[11]；紅游動(dòng)菌屬 (Rhodoplanes) 可能是引起西洋參根腐病發(fā)生的關(guān)鍵菌群[12]；慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)能夠利用糖類及有機(jī)酸，但更傾向于利用戊糖，前人研究發(fā)現(xiàn)該屬細(xì)菌對(duì)抗生素的抗藥性比固氮根瘤菌強(qiáng)[13]；寡養(yǎng)單胞菌屬 (Stenotrophomonas)可以降解有機(jī)農(nóng)藥 、進(jìn)行廢水處理和污染水體的修復(fù)、部分寡養(yǎng)單胞菌對(duì)農(nóng)藥具有生物轉(zhuǎn)化活性[14]；節(jié)桿菌屬 (Arthrobacter) 具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性，研究發(fā)現(xiàn)該屬菌株具有高效降解環(huán)境中的有機(jī)污染物和吸附重金屬的能力，被用于污染水體和土壤等的生物修復(fù)研究與應(yīng)用[15]。中性磷酸酶含量較低的樣地中豐度較高的為(WR、ZR、TR)紅色桿菌屬(Rubrobacter)是對(duì)于適應(yīng)沙漠干旱、強(qiáng)輻射等極端環(huán)境具有重要作用[16]；新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium) 普遍具有降解芳烴 (芳香族) 化合物的特性是良好的芳烴污染環(huán)境的生物修復(fù)菌[17]。

在新疆北部不同樣地的苜蓿根際細(xì)菌群落一級(jí)功能層中, 中性磷酸酶含量較高的樣地(SR、XR、ER)中豐度較高的有機(jī)體系統(tǒng)、新陳代謝、遺傳信息處理這3類功能基因使土壤細(xì)菌代謝旺盛，從土壤中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)攝取氨基酸、能量、碳水化合物等來(lái)保證細(xì)菌的存活從而提高了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性[18]；中性磷酸酶含量較低的樣地(WR、TR)中環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程功能基因豐度較高，通過(guò)這些功能基因可以從土壤中攝取更多的核苷酸、氨基酸，提高了細(xì)菌多樣性[19]。

4 結(jié) 論

細(xì)菌多樣性主要受土壤中性磷酸酶影響，根際與非根際及不同地區(qū)間，所測(cè)12個(gè)土樣類型的序列共分屬于51個(gè)門，共同擁有的有22個(gè)門，共分屬于600個(gè)屬；其中12個(gè)土樣類型共同擁有的有190個(gè)屬，細(xì)菌群落組成相似，但物種豐富度存在一定差異。土壤細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)中一級(jí)功能層中遺傳信息處理(Genetic_Information_Processing)、有機(jī)體系統(tǒng)(Organismal_Systems)、新陳代謝(Metabolism)、未分類(Unclassified)、人類疾病(Human_Diseases)、環(huán)境信息處理(Environmental_Information_Processing)、細(xì)胞過(guò)程(Cellular_Processes)豐度較高。