靳元元，馬生軍，徐萬(wàn)里，張 軍，耿 陽(yáng)，吳文平，王雪雙

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所，烏魯木齊 830092；3.特克斯礪劍鋒農(nóng)林科技有限公司 ，新疆特克斯 835500)

0 引 言

【研究意義】黃芪根中含有皂苷、黃酮、多糖和氨基酸等多種活性成分[1]及微量元素硒。黃芪具有保護(hù)血管、調(diào)節(jié)免疫[2]。對(duì)不同產(chǎn)地黃芪進(jìn)行活性成分與硒含量的比較分析，為黃芪資源的開發(fā)利用提供理論參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】中藥黃芪為扶正益氣中藥[3,4]。我國(guó)傳統(tǒng)中藥富含天然有機(jī)硒，研究顯示黃芪是硒富集中藥中的一種[5]。吳應(yīng)亮等[6]探究了黃芪、絞股藍(lán)等多種富硒植物，發(fā)現(xiàn)黃芪中含有硒皂苷和硒多糖，不同產(chǎn)地黃芪的活性成分含量比較分析已有諸多研究[7-10]，但其與硒含量的相關(guān)性尚未報(bào)道。富硒黃芪的種植可通過添加適量的外源硒得到高富硒黃芪[11]，或通過活化富硒土壤來(lái)提高植物的硒含量[12]。目前治療疾病的黃芪新劑型，如黃芪口服液、黃芪顆粒、黃芪膠囊等[13]。【本研究切入點(diǎn)】黃芪作為藥食同源的中藥材，可作為藥品，也可作食品相關(guān)的功能產(chǎn)品[14]。市場(chǎng)上的黃芪藥材產(chǎn)地較廣，品質(zhì)差異較大[15,16]。目前黃芪的研究主要集中在皂苷、黃酮、多糖等成分，而對(duì)其硒元素研究較少。不同產(chǎn)地黃芪由于地理環(huán)境和土壤條件的不同，其生物學(xué)特性和活性成分有一定的差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以22個(gè)不同產(chǎn)地黃芪為材料，研究不同產(chǎn)地黃芪活性成分和硒含量的差異，為富硒黃芪資源的開發(fā)和綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

黃芪藥材樣品于2018年8月分別采集自新疆、甘肅、山西、內(nèi)蒙古、寧夏、吉林、陜西等7個(gè)省份、22個(gè)不同產(chǎn)地，均為2年生人工栽培蒙古黃芪的干燥根，每個(gè)采樣地點(diǎn)均隨機(jī)選取15株無(wú)明顯病害的黃芪植株。表1

表1 不同產(chǎn)地黃芪樣品信息

2018年于新疆特克斯縣采集5個(gè)不同時(shí)期的2年生蒙古黃芪和土樣。每個(gè)時(shí)期均隨機(jī)選取15株無(wú)明顯病害的黃芪植株，采集土樣深度0～40 cm。

黃芪樣品50℃烘干，各產(chǎn)地各時(shí)期15株黃芪樣品全部粉碎后混勻，過60和100目(測(cè)硒)篩備用；土樣自然晾干，木棍碾碎混勻后過100目篩備用。

1.2 方 法

黃芪中總皂苷、總黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、總多糖及硒含量的測(cè)量具體方法如下述，每個(gè)指標(biāo)各樣品均設(shè)3次重復(fù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各指標(biāo)的含量。

1.2.1 總皂苷含量的測(cè)定

總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精準(zhǔn)稱取黃芪甲苷對(duì)照品2.07 mg，置于10 mL容量瓶中，配制成0.207 mg/mL的甲醇溶液。分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液0.02，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL，于具塞玻璃試管中，空氣吹干后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，于60℃水浴加熱20 min，取出后立即冰浴，冷卻至室溫，再加入冰醋酸5 mL，搖勻；以空白溶劑同法處理作參比，于541 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。

試樣的配制：取不同產(chǎn)地粉碎的黃芪樣品0.5 g(過60目)，精密稱定，加甲醇25 mL，加熱回流1 h，過濾，減壓回收甲醇(65℃)，殘?jiān)?5 mL水飽和正丁醇分3次轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，氨試液洗滌3次，每次15 mL，正丁醇層減壓回收至干，用甲醇溶解，溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻。精密吸取0.5 mL溶液至具塞玻璃試管中，空氣吹干后，后同標(biāo)準(zhǔn)品，作為供試品溶液。

1.2.2 UV法測(cè)定黃芪中總黃酮含量

總黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精準(zhǔn)稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品粉末3.20 mg，置于50 mL容量瓶中，配置成0.064 mg/mL的甲醇溶液。分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液1、2、6、8、10 mL置于25 mL容量瓶中甲醇定容至刻度，于260 nm下測(cè)定吸光度。

試樣的配制：取不同產(chǎn)地粉碎的黃芪樣品0.5 g(過60目)，精密稱定，量取50 mL甲醇于平底燒瓶中，加熱回流1 h，過濾后置于65℃減壓回收至干，用色譜甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，搖勻；再移取1.0 mL定溶液至25 mL容量瓶中，用分析甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.3 HPLC法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(含0.3%磷酸)，梯度洗脫：0～5 min，A為10%～15%；5～15 min，A為15%～23%；15～30 min，A為23%～38%；流速1.0 mL/min；柱溫：35℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。該條件下繪出毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品和樣品色譜圖。圖1

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(a)和樣品色譜圖(b)

1.2.3.2 不同產(chǎn)地黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測(cè)定

毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精準(zhǔn)稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品1.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇(色譜純)溶解并稀釋至刻度，配制成0.04 mg/mL的甲醇溶液。分別進(jìn)樣1、3、5、7、10、12 μL，按1.2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

試樣的配制：取不同產(chǎn)地粉碎的黃芪樣品0.5 g(過60目)，精密稱定，量取50 mL甲醇于平底燒瓶中，加熱回流1 h，過濾后置于65℃減壓回收至干，用色譜甲醇溶解，定容至10 mL容量瓶，搖勻；經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

1.2.4 苯酚—硫酸法測(cè)定黃芪中總多糖含量

D(+)-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精確稱取D(+)-無(wú)水葡萄糖50.0 mg，置于100 mL容量瓶中，配制成0.5 mg/mL的D(+)-無(wú)水葡萄糖水溶液。分別精確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 mL，置于25 mL量瓶中定容，搖勻。精密吸取上述各溶液1 mL，置于10 mL 具塞試管中，加新配置的5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，緩緩加入5 mL濃硫酸，搖勻，90℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫。同時(shí)做空白試劑，于490 nm下測(cè)定吸光度。

試樣的配制：取不同產(chǎn)地粉碎的黃芪樣品0.5 g(過60目)，精密稱定，加入25 mL乙醇溶液浸泡超聲提取(功率500/600 W，頻率40 kHz，溫度80℃)2次，每次20 min，過濾；將濾渣用25 mL蒸餾水在相同條件下提取2次，合并2次濾液，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，將殘?jiān)盟礈?次，洗液并入容量瓶中，定容，搖勻；精密吸取0.2 mL溶液于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水1.8 mL，后同標(biāo)準(zhǔn)品，作為供試品溶液。

1.2.5 原子熒光法測(cè)定黃芪中硒含量

取不同產(chǎn)地粉碎的黃芪樣品0.5 g(過100目)，精密稱定，采用氫化物原子熒光光譜法，按 GB5009.93-2010項(xiàng)下“微波消解”處理操作，進(jìn)行含量測(cè)定。

檢測(cè)與條件：負(fù)高壓280 V，原子化器高度8 mm，燈電流80 mA，載氣和屏蔽氣流量分別為400和800 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行基礎(chǔ)整理分析，采用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)軟件，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著分析、相關(guān)性分析。

使用 IBM SPSS Statistics 22對(duì)不同產(chǎn)地黃芪藥材中主要活性成分總皂苷、總黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、總多糖和硒的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類，以5種活性成分含量為聚類的變量，選擇組間聯(lián)結(jié)作為聚類方法，采用平方Euclidean距離獲得聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

分別以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、D(+)-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制總皂苷、總黃酮、總多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；以毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線；以硒標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制硒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2

表2 線性關(guān)系

2.2 不同產(chǎn)地黃芪活性成分與硒含量比較

研究表明，7個(gè)省份不同產(chǎn)地黃芪藥材的主要活性成分和硒含量有顯著差異(P<0.05)?？傇碥蘸孔罡叩氖巧轿魇∑紧攨^(qū)為1.557%，最低的是陜西省靖邊縣為0.630%；總黃酮含量最高的產(chǎn)地是新疆昭蘇縣為0.472%，最低的是新疆哈密市為0.153%；除新疆圖木舒克市、甘肅岷縣和內(nèi)蒙古林東縣外，其他19個(gè)產(chǎn)地黃芪的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量能達(dá)到《中國(guó)藥典》的要求0.020%；新疆博湖縣的總多糖含量和硒含量均是最高，含量分別為27.617%、0.323 mg/kg，總多糖含量最低的是山西渾源縣6.283%，硒含量最低的是甘肅省漳縣0.112 mg/kg。表3

表3 不同產(chǎn)地黃芪5種成分含量

研究表明，不同省份黃芪藥材的活性成分含量有顯著差異(P<0.05)，硒含量無(wú)顯著差異。其中新疆產(chǎn)地的硒、總皂苷和總多糖含量是最高的，分別是0.184 5 mg/kg、1.233%、18.662%；而黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高的為寧夏產(chǎn)地，分別為0.412%、0.091 4%。內(nèi)蒙古產(chǎn)地黃芪最低，含量為0.131 7 mg/kg；就總皂苷而言，陜西產(chǎn)地最低，含量為0.630%；山西產(chǎn)地黃芪總多糖含量最低為8.205%。表4

表4 不同省黃芪5種成分含量比較

2.3 不同時(shí)期黃芪根部與土壤硒含量

研究表明，根部的硒含量呈上升趨勢(shì)，并在最后生長(zhǎng)階段硒含量達(dá)到0.28 mg/kg，土壤硒含量呈下降趨勢(shì)，二者間可能存在一定的相關(guān)性。圖2

圖2 不同時(shí)期黃芪根部與土壤硒的含量

2.4 黃芪中硒與活性成分的相關(guān)性

研究表明，微量元素硒的含量與總多糖含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.609，與總皂苷含量呈顯著相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.477，黃芪中硒元素與總多糖和皂苷含量密切相關(guān)；總黃酮的含量與毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.540。表5

表5 相關(guān)性

2.5 含量聚類

使用 IBM SPSS Statistics 22對(duì)不同產(chǎn)地黃芪藥材中主要活性成分總皂苷、總黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、總多糖和硒的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)聚類，以5種活性成分含量為聚類的變量，選擇組間聯(lián)結(jié)作為聚類方法，采用平方Euclidean距離獲得聚類分析樹狀圖。研究表明，22批黃芪樣品在閾值為5時(shí)可分為3類，其中H1、4、8、12、14～19、21～22為一類，主要特征是各化學(xué)成分含量較平均；H2～3、5～6、13、20被聚為一類，主要特征是毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量較高；H7、9～11為一類，主要特征是總多糖含量較高。圖3

圖3 不同產(chǎn)地22批黃芪樣品聚類

3 討 論

研究中對(duì)22個(gè)不同產(chǎn)地黃芪總皂苷、總黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、總多糖與硒元素的含量進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)7個(gè)省份黃芪對(duì)比分析，結(jié)果顯示，22個(gè)產(chǎn)地黃芪的總皂苷、總黃酮、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、總多糖與硒元素的含量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中作為傳統(tǒng)地道產(chǎn)區(qū)的山西平魯區(qū)總皂苷含量最高為1.557%，最低的是陜西省靖邊縣為0.630%?？傸S酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最高的為寧夏產(chǎn)地，分別為0.412%、0.091 4%，與田文倉(cāng)等[17]研究的育苗移栽蒙古黃芪中寧夏產(chǎn)地總黃酮含量最高一致。新疆產(chǎn)地的總皂苷和多糖含量是最高的，分別是1.233%、18.66%，這可能與新疆地域遼闊，日照時(shí)間長(zhǎng)、晝夜溫差大等條件有關(guān)，故采收的黃芪產(chǎn)量高、品質(zhì)高[18]。

22個(gè)不同產(chǎn)地黃芪的硒含量范圍在0.111 6～0.329 7 mg/kg，其中新疆博湖縣產(chǎn)地的黃芪含硒量最高為 0.329 7 mg/kg，博湖縣屬于新疆目前發(fā)現(xiàn)的富硒土壤地區(qū)中的焉耆盆地富硒區(qū)，其中黃芪有較高的硒生物積累能力[19]。據(jù)研究，植物的含硒量與植物種類和土壤含硒量密切相關(guān)[20]，中藥材中的硒含量與不同富硒區(qū)域土壤硒含量呈正相關(guān)[21]，故博湖產(chǎn)地黃芪含硒量高。對(duì)于土壤硒含量少的產(chǎn)地，可以通過改良土壤或施加外源硒的方式來(lái)增加硒的含量[22,23]。

對(duì)同一產(chǎn)地不同時(shí)期采收的黃芪硒元素含量測(cè)定結(jié)果表明，采收時(shí)期對(duì)黃芪硒含量是有一定的影響，但黃芪中活性成分含量和硒含量受土壤及環(huán)境因素的影響，對(duì)于其他產(chǎn)地的黃芪采收時(shí)期還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

硒是動(dòng)植物必須的一種微量元素，植物體在吸收硒后可以與多糖結(jié)合，以硒多糖的有機(jī)硒形式存在植物體中[24,25]。研究表明，黃芪中硒含量與總多糖含量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，與總皂苷的含量也呈現(xiàn)顯著(P<0.05)相關(guān)性，可能是黃芪中硒與總多糖及皂苷結(jié)合形成硒多糖和硒皂苷。有研究顯示，隨著硒含量的升高，植物體多糖、皂苷、黃酮的含量也會(huì)隨著上升[26,27]，可以推測(cè)出植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的某個(gè)階段，化學(xué)成分之間可能出現(xiàn)物質(zhì)積累的相似趨勢(shì)，但具體原因還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

聚類分析根據(jù)不同閾值可把22批黃芪分為3大類或5小類，黃芪藥材以總皂苷等5種化學(xué)成分為指標(biāo)在地理環(huán)境等方面的差異是存在的。在閾值為5時(shí)可將新疆博湖縣、烏魯木齊市達(dá)板城區(qū)、圖木舒克市、甘肅渭源縣產(chǎn)地黃芪分為一類，其特征是總多糖含量高，且硒含量也均在廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《富硒農(nóng)產(chǎn)品硒含量分類要求》的0.15～2.0 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，除甘肅渭源縣產(chǎn)地外，新疆博湖縣、烏魯木齊市達(dá)板城區(qū)、圖木舒克市產(chǎn)地黃芪的皂苷含量均較高，正好對(duì)應(yīng)相關(guān)性分析中，黃芪硒含量與總多糖含量呈極顯著相關(guān)、與皂苷含量呈顯著相關(guān)的結(jié)果。

4 結(jié) 論

不同產(chǎn)地黃芪藥材具有一定的差異性，總皂苷含量在0.630%～1.444%，山西省平魯區(qū)居高；總黃酮含量在0.153%～0.472%，新疆昭蘇縣居高；毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量除新疆圖木舒克市、甘肅岷縣和內(nèi)蒙古林東縣外，其他19份黃芪藥材均達(dá)到藥典0.020%的要求；新疆產(chǎn)地的黃芪總皂苷和總多糖含量最高，分別是1.233%、18.662%。不同產(chǎn)地土壤條件下黃芪中硒的含量具有差異，同一產(chǎn)地土壤條件下黃芪中硒的含量也具有差異，為富硒黃芪的種植提供了參考。此外，硒含量與總多糖含量呈極顯著正相關(guān)，新疆博湖縣、烏魯木齊市達(dá)板城區(qū)、圖木舒克市、甘肅渭源縣產(chǎn)地黃芪特征是總多糖含量高，且硒含量也均在富硒標(biāo)準(zhǔn)0.15～2.0 mg/kg。