武 赟，胡文靜，尚楊楊，汪榮泉

結(jié)直腸癌是全世界最常見的腫瘤之一，在癌癥相關(guān)死亡原因中占第四位[1]。鑒定新的結(jié)直腸癌患者預(yù)后標(biāo)志物具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

miRNA對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑至關(guān)重要，參與多種生物學(xué)功能，如通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)各種癌基因和抑癌基因的表達(dá)控制細(xì)胞增殖，分化和凋亡；而且維持胚胎干細(xì)胞和人類腫瘤干細(xì)胞干性[2-4]。Ascl2編碼的轉(zhuǎn)錄因子控制著腸道隱性干細(xì)胞和結(jié)腸癌祖細(xì)胞的命運(yùn)[5-6]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞中Ascl2可以調(diào)控miRNA-200s的表達(dá)，從而對(duì)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的可塑性產(chǎn)生影響，也可通過let-7b等調(diào)節(jié)結(jié)直腸前體細(xì)胞的干性[7-8]。

本研究使用生物信息學(xué)的方法，鑒定miRNA相關(guān)的Ascl2靶基因，并對(duì)其進(jìn)行GO、KEGG分析，通過繪制PPI網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵基因，進(jìn)一步結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)集，探索其對(duì)結(jié)直腸癌患者潛在的臨床預(yù)后價(jià)值，為結(jié)直腸癌提供新預(yù)后標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 GSE34926和GSE69036表達(dá)數(shù)據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，分別為對(duì)LS174T細(xì)胞干擾Ascl2表達(dá)前后miRNA與mRNA差異表達(dá)數(shù)據(jù)。545例結(jié)直腸癌病人臨床數(shù)據(jù)及目標(biāo)基因表達(dá)量來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 差異表達(dá)基因鑒定 GSE34926是比較干擾Ascl2前后的LS174T細(xì)胞的miRNA表達(dá)芯片的數(shù)據(jù)集。設(shè)定當(dāng)Fold Change＞2或Fold Change＜0.5時(shí)，認(rèn)為miRNA表達(dá)有顯著差異。將標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)值取log2后，使用Helm繪圖軟件進(jìn)行熱圖繪制。將得到的miRNA通過TargetScanHuman與miRBD進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，再通過Venn圖尋找交集，得到Ascl2所介導(dǎo)差異表達(dá)的miRNA下游基因集，記為DEGs1。 數(shù)據(jù)集GSE69036為對(duì)LS174T細(xì)胞進(jìn)行Ascl2干擾后與對(duì)照組相比，得出的受Ascl2所調(diào)控的下游靶基因。設(shè)定當(dāng)Fold Change＞1.5或Fold Change＜0.67時(shí)，認(rèn)為Ascl2干擾對(duì)此基因的表達(dá)有顯著的影響，記為DEGs2。DEGs1與DEGs2之間的交集定義為miRNA相關(guān)的Ascl2的靶基因，并繪制Venn圖。

1.3 GO、KEGG Pathway分析 對(duì)miRNA相關(guān)的Ascl2的靶基因進(jìn)行GO分析[9]與KEGG Pathway分析[10]，利用可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID）完成，并使用R軟件中的ggplot2程序包完成結(jié)果的可視化。

1.4 制作差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) DEGs的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI network）使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建。設(shè)定綜合得分＞0.4的相互作用關(guān)系認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。通過Cytoscape軟件及其插件cytohubba篩選degree≥10的基因?yàn)殛P(guān)鍵基因并繪制關(guān)鍵基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖[12]。

1.5 結(jié)直腸癌患者的生存分析 使用x-tile軟件篩選合適的cut-off值，分別將每個(gè)關(guān)鍵基因劃分成相對(duì)高表達(dá)組與相對(duì)低表達(dá)組，通過Kaplan-Meier方法進(jìn)行從3方面進(jìn)行生存分析：總體生存率（OS）、無進(jìn)展生存率（FPS）、疾病特異性生存率（DDS）。

2 結(jié)果

2.1 miRNA的差異表達(dá)及可視化 本課題前期對(duì)LS174T細(xì)胞行Ascl2干擾，對(duì)比分析干擾前后的LS174T細(xì)胞的miRNA芯片，其芯片結(jié)果發(fā)表在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE34926）。目前對(duì)GSE34926分析，發(fā)現(xiàn)在LS174T細(xì)胞被干擾Ascl2表達(dá)后，共有符合條件的350個(gè)miRNA出現(xiàn)差異性表達(dá)（172個(gè)上調(diào)，178個(gè)下調(diào)）。將標(biāo)準(zhǔn)化后的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)取log2，使用Helm繪圖軟件進(jìn)行熱圖繪制（圖1A：紅色條帶代表此miRNA相對(duì)高表達(dá)，綠色條帶代表此miRNA相對(duì)低表達(dá)。）。

2.2 差異表達(dá)基因鑒定 將符合條件的350個(gè)miRNA使用TargetScanHuman與miRBD分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，再利用Venn圖法尋找交集，得到Ascl2所介導(dǎo)差異表達(dá)的miRNA下游基因集，記為DEGs1。GSE69036為對(duì)LS174T細(xì)胞進(jìn)行Ascl2干擾后與對(duì)照組相比得出的受Ascl2所調(diào)控的下游靶基因，它們包括由Ascl2直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因、通過miRNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因，以及經(jīng)過其他分子中介調(diào)控的靶基因，這些差異表達(dá)的靶基因記為DEGs2。進(jìn)一步，本研究利用Venn圖繪制工具對(duì)DEGs1和DEGs2進(jìn)行交集，共得到534個(gè)差異性表達(dá)基因（圖1B），它們是Ascl2下游并且與miRNA相關(guān)的靶基因，記為差異性表達(dá)基因DEGs。

2.3 GO、KEGG Pathway分析 為了進(jìn)一步揭示Ascl2下游并且與miRNA相關(guān)的靶基因的功能進(jìn)行GO分析：分子功能上，DEGs富集在與蛋白質(zhì)的結(jié)合，與金屬離子的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子的活動(dòng)，與特定序列DNA的結(jié)合等方面；細(xì)胞組成上，DEGs主要富集在膜的組成部分，質(zhì)膜成分，胞液、高爾基體及高爾基體質(zhì)膜中；生物過程上，DEGs主要富集在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（包括RNA多聚酶Ⅱ啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)控以及以DNA為模板的正調(diào)控），多細(xì)胞生物的發(fā)展等方面（圖2）。KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)DEGs集中在代謝相關(guān)通路、HTLV-I感染、MAPK信號(hào)通路、與癌癥中的蛋白聚糖、癌癥相關(guān)的miRNA等信號(hào)通路中（圖3）。

2.4 差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)對(duì)534個(gè)DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，用Cytoscape軟件從其中467個(gè)有相互作用關(guān)系的基因中篩選出43個(gè)關(guān)鍵基因（degree≥10）。并使用Cytoscape軟件中的cytohubba插件，將43個(gè)關(guān)鍵基因繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4：紅色表示相互作用關(guān)系較多，黃色表示相互作用關(guān)系較少）。

2.5 結(jié)直腸癌患者的生存分析 為了揭示43個(gè)關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能以及臨床可能的應(yīng)用前景，筆者使用x-tile軟件獲得它們的cut-off值，將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的545例樣本劃分為相對(duì)高表達(dá)和相對(duì)低表達(dá)組，用Kaplan-Meier對(duì)43個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)量與患者生存率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)包括TP53、NRAS、WDTC1、TGFBR1、RAB1A、DYNLL2、RPS6KB1、COL1A1、CDKN1A、TNRC6A、DNMT3A、MAPT、RBBP5、PPARA、SERPINA1、COPG1、CCNE2、RAB6A、RYK、COPS3、FA2H、PRMT6、ANK1共23個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量與患者總體生存率相關(guān)（P＜0.05）。本課題對(duì)結(jié)直腸癌患者中沒有預(yù)后研究報(bào)道的RAB6A、DYNLL2、COPS3和COPG1 4個(gè)基因進(jìn)行生存分析。

RAB6A、DYNLL2、COPS3和COPG1表達(dá)影響結(jié)直腸癌患者總體生存率（P=0.0280，P=0.0176，P=0.0188，P=0.0276）；DYNLL與COPS3的表達(dá)影響疾病特異性生存率（P=0.0191，P=0.0394）；COPS3的表達(dá)還影響無進(jìn)展生存率（P=0.0446，圖5）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)化后miRNA取log2熱圖繪制及圖法尋找交集

圖2 對(duì)差異性表達(dá)基因DEGs的GO分析

圖3 對(duì)差異性表達(dá)基因DEGs的KEGG Pathway分析

圖4 DEGs中43個(gè)關(guān)鍵基因（degree≥10）的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖thway分析

3 討論

Ascl2是一種與結(jié)直腸癌高度相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，目前對(duì)于其靶基因的研究是熱點(diǎn)之一，本研究通過對(duì)本課題前期發(fā)表GSE34926進(jìn)行分析，鑒定出Ascl2被干擾后差異表達(dá)的miRNA[7]。對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并結(jié)合數(shù)據(jù)集GSE69036，共鑒定出534個(gè)與miRNA相關(guān)的Ascl2靶基因（DEGs）。行GO分析、KEGG Pathway分析，通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出較為關(guān)鍵的43個(gè)基因，，結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存分析，共鑒定出23個(gè)基因表達(dá)量的高低對(duì)總體生存率有顯著影響（P＜0.05），其中RAB6A、DYNLL2、COPS3和COPG1四個(gè)基因與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后研究缺乏文獻(xiàn)報(bào)道，研究其表達(dá)量與結(jié)直腸癌病人臨床預(yù)后關(guān)系對(duì)鑒定新預(yù)后標(biāo)志物有指導(dǎo)價(jià)值。

圖5 RAB6A、DYNLL2、COPS3和COPG1表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后分析

Rab6A是Rab蛋白家族的一員，它位于高爾基池，以及負(fù)高爾基管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的多種蛋白共同參與順行轉(zhuǎn)運(yùn)，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊環(huán)境[13-14]。COPG1（衣被蛋白復(fù)合物亞基γ-1）一種細(xì)胞質(zhì)蛋白復(fù)合物，能夠通過與高爾基非網(wǎng)格蛋白包被的小泡可逆結(jié)合，介導(dǎo)生物合成蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過高爾基到反式高爾基網(wǎng)絡(luò)的運(yùn)輸。在GO分析發(fā)現(xiàn)DEGs在高爾基體以及高爾基體膜有較明顯的富集，Rab6A及COPG1可能是通過蛋白翻譯后修飾的過程影響細(xì)胞命運(yùn)。Rab6A表達(dá)量與總體生存率呈正相關(guān)，而COPG1表達(dá)量與總體生存率呈負(fù)相關(guān)。DYNLL2又名為肝癌2缺失基因(DLC2)可以抑制肝細(xì)胞癌(HCC)的細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)化[15-16]。其在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)提示較高的總體生存率和較高的疾病特異性生存率。

COPS3是COP9信號(hào)小體復(fù)合體(CSN)的第三亞基，CSN參與了廣泛的生物學(xué)過程，如細(xì)胞因子信號(hào)、早期發(fā)育、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)程和轉(zhuǎn)錄激活及腫瘤發(fā)生[17]。COPS3的擴(kuò)增與肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，COPS3高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的總體生存率、無進(jìn)展生存率以及疾病特異性生存率均呈明顯的正相關(guān)。

綜上所述，本鑒定出結(jié)直腸癌細(xì)胞Ascl2可通過miRNA調(diào)控具有不同的生物學(xué)功能的靶基因，其中COPS3、DYNLL2、RAB6A與COPG1可成為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的新標(biāo)志物。