賈欽堯，宋 珊，王 濤，向小均

非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是肺癌中最常見的一種類型，在腫瘤中致死率最高。目前，第三代細胞毒藥物聯(lián)合鉑類仍然是治療晚期NSCLC標(biāo)準(zhǔn)化療手段，但是腫瘤細胞基因的多態(tài)性往往會導(dǎo)致腫瘤細胞的異質(zhì)性，以致化療藥物療效個體差異較大，因此針對基因多態(tài)性調(diào)整化療方案并實現(xiàn)個體化用藥已成為臨床治療共識。超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase，SOD2)是一類可以催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化反應(yīng)的金屬酶，在組織活性氧代謝中發(fā)揮重要作用，可能參與NSCLC耐藥相關(guān)信號通路的激活[1]。核糖核苷酸還原酶亞單位1（ribonucleotide reductase M1，RRM1）可修復(fù)被鉑類藥物損傷的DNA，從而增加腫瘤細胞的耐藥性，降低化療受益率，其基因多態(tài)性可能影響晚期NSCLC的化療效果[2]。本研究通過檢測RRM1和SOD2基因多態(tài)性研究其和晚期NSCLC患者鉑類化療臨床效果的相關(guān)性，探討二者在晚期NSCLC治療中的臨床意義，為NSCLC精準(zhǔn)醫(yī)療探尋理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 病例資料 本研究采取隨機數(shù)字法，隨機抽取2017年5月～2019年10月來醫(yī)院呼吸內(nèi)科治療，且經(jīng)過病理切片結(jié)果診斷、3期或4期不能手術(shù)、病灶較大達到可以測量目的初治原發(fā)性肺癌患者252例，男性150例，女性102例，年齡31～78歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，患者入組前均簽署知情同意書，且該研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)、影像學(xué)（CT、X線）、纖支鏡活檢、肺穿刺等檢測確診為NSCLC；（2）Karnofsky評分≥70分，且預(yù)計生存期≥3個月，至少1個可測量病灶；（3）根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅲa～Ⅳ期；（4）機體狀況可耐受化療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他危及生命的疾病患者；（2）治療過程中存在的嚴重不良反應(yīng)（中性粒細胞降低、神經(jīng)毒性以及外周神經(jīng)炎患者）危及患者生命安全；（3）存在哺乳期或孕產(chǎn)期婦女患者；（4）嚴重心臟、肝、腎功能障礙的患者；（5）對本研究藥物過敏或者不耐受患者。

1.2 研究方法 所有患者均在醫(yī)院接受以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療，如選擇紫杉醇、吉西他濱或者培美曲塞+順鉑/卡鉑，對于存在基因突變的患者，可接受靶向治療，具體用藥方案參照《Ⅲ期非小細胞肺癌多學(xué)科診療專家共識》中的常規(guī)推薦劑量[3]。

1.3 基因型分析方法 抽取患者治療前的外周靜脈血，使用EDTA抗凝處理后的全血(3 ml)在2500 r/min狀態(tài)下離心2 min，取細胞上清得到血漿，通過QIAAMPDNA Blood Mini Kit試劑盒進一步純化血漿DNA，得到血漿后放置-20℃保存待測。根據(jù)Genebank發(fā)布的人SOD2和RRM1基因序列采用Primer 5.0軟件分別對相關(guān)位點設(shè)計引物。PCR反應(yīng)體系為25μl，其中含10xbuffer 2.5μl、dNTPS 1μl、Taq DNA聚合酶0.4μl、DNA模板1uμl、引物1μl、ddH20補足。擴増方法：95℃條件下預(yù)變性5 min，94℃變性半分鐘，50～60℃退火時間30 s，72℃延伸10 min，共35個循環(huán)。通過試劑盒回收目標(biāo)片段，處理后通過DNA測序儀完成測定。

1.4 療效評價 所有患者在使用含鉑給藥方法化療2個周期，使用胸部CT對療效復(fù)查，后續(xù)每1個周期進行療效評價，聯(lián)合化療4個周期后停止化療方案，臨床效果分為完全好轉(zhuǎn)（CR）、部分好轉(zhuǎn)(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD),客觀緩解率為CR+PR，毒性反應(yīng)按National Cancer Institute毒性反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)(NCICITC3.0)評定[3]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析。其中計數(shù)資料以例和百分率表示，采用χ2檢驗，均以P＜0.05表示差異顯著。采用Log-rank檢驗比較不同基因型的生存率，采用Cox比例風(fēng)險模型評估各影響因素對化療效果的影響。

2 結(jié)果

2.1 RRM1及SOD2的基因型及等位基因頻率分布情況 RRM1基因RR37AC位點存在3種基因型：C/C、C/A、A/A，例數(shù)分別為74例、112例、66例。RRM1基因RR524CT位點存在3種基因型：C/C、C/T、T/T， 例數(shù)分別為102例、103例、47例。SOD2 SNPrs5746136位點存在3種基因型：G/G、G/A、A/A，例數(shù)分別為91例、107例、54例。SOD2 SNPrs2758331位點存在3種基因型：C/C、C/A、A/A，例數(shù)分別為72例、95例、85例。SOD2 SNPrs4880位點存在3種基因型：T/T、T/C、C/C，例數(shù)分別為98例、74例、80例。以上各基因位點基因型的觀測值、期望值符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 臨床療效 252例患者中完全緩解54例，部分緩解68例，疾病穩(wěn)定102例，疾病進展28例，其中總體客觀緩解率（CR+PR）為48.41%（122例），疾病控制率(CR+PR+SD)為88.89%（224例）。

2.3 化療療效的單因素分析 依據(jù)治療效果將患者分為：CR和PR為化療有效組（122例），SD和PD為化療無效組（130例）。兩組患者的TNM分期、RRM1 RR524CT基因型以及SOD2 SNPrs4880基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.4 影響化療結(jié)局的多變量Cox模型 經(jīng)過多變量校正，TNM分期（HR值為2.450）、SOD2 SNPrs4880基因型（HR值為2.085）以及RRM1 RR524CT基因型（HR值為1.523）對化療結(jié)局有獨立的影響意義（P＜0.05），見表2。

2.5 RRM1及SOD2基因多態(tài)性對預(yù)后的影響化療結(jié)束后隨訪1年，死亡66例。RRM1 SNPrs488基因型C/C、其他（T/C、T/T）死亡人數(shù)分別為16例、48例，C/C、其他基因型的生存曲線見圖1，不同基因型病死率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.470,P＜0.05）。SOD2 SNPrs488基因型C/C、其他（T/C、T/T）死亡人數(shù)分別為30例、36例，C/C、其他基因型的生存曲線見圖2，不同基因型病死率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.755,P＜0.05）。

表1 化療療效的單因素分析

表2 影響化療結(jié)局的多變量Cox模型

2.6 RRM1及SOD2聯(lián)合基因型與化療效果的關(guān)系 RRM1及SOD2多態(tài)性間在化療敏感性方面存在明顯的相互作用，攜帶至少1個RRM1 RR524位點的C等位基因和SOD2 SNPrs4880位點的T等位基因的化療有效率明顯高于其他基因型攜帶者（P＜0.05），見表3。

圖1 RRM1 SNPrs488 C/C基因型、其他基因型的生存曲線

圖2 SOD2 SNPrs488 C/C基因型、其他基因型的生存曲線

3 討論

肺癌是現(xiàn)在發(fā)病率較高的腫瘤之一，其病死率為世界第一[4]。NSCLC占肺癌發(fā)病率的85%，由于癥狀不明顯，所以大部分的患者就醫(yī)時發(fā)現(xiàn)已進展至晚期[5-6]。化學(xué)治療是最常見的治療手段，三代細胞毒藥物聯(lián)合鉑類仍然是標(biāo)準(zhǔn)一線化療手段[7-9]。而在本研究中，患者經(jīng)過一線治療方案失敗后，采取二線治療方案，二線治療方案主要采取培美曲塞進行治療。本研究通過分析患者一線治療中的RRM1及SOD2基因多態(tài)性與晚期NSCLC鉑類化療的相關(guān)性，為患者的治療提供精準(zhǔn)依據(jù)。

SOD是一類可以催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化反應(yīng)的金屬酶[10]，文獻中報道發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中SOD2含量均異常增高，如王小俊等[9,11]研究發(fā)現(xiàn)SOD2基因多態(tài)性與小兒隨母細胞瘤的順鉑用藥耳毒性相關(guān)，即基因多態(tài)性導(dǎo)致SOD2蛋白在結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生異變，最終影響化療藥物的藥效。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOD2 SNPrs4880基因型（HR值為2.085）是影響化療結(jié)局的獨立危險因素，其中攜帶突變等位基因的雜合子(TC)及突變純合子(CC)對含鉑方案的敏感率均低于野生純合子(TT)，且隨訪1年，SNPrs488基因型T/T的病死率顯著低于其他（T/C、C/C），表明突變等位基因C會降低化療的效果。SOD2 SNPrs4880基因位點的纈氨酸突變?yōu)楸彼幔═→C），導(dǎo)致SOD2上的線粒體靶向序列變化，使得該序列含有1個α螺旋結(jié)構(gòu)，有利于SOD2前體經(jīng)線粒體膜的轉(zhuǎn)運過程，導(dǎo)致突變后的SOD2活性增加，從而增加了腫瘤細胞抵抗ROS應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷和降低腫瘤細胞的調(diào)亡，故而降低了含鉑化療方案的療效。

RRM1基因可合成編碼核糖核苷酸還原酶中的M1亞基，進而加強損傷DNA的修復(fù)，體內(nèi)和體外實驗中都發(fā)現(xiàn)RRM1的過量表達會降低細胞的運動、遷徙和轉(zhuǎn)移的作用，達到抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)RRM1 RR524CT基因型（OR值為1.523）是影響化療結(jié)局的獨立危險因素，且RRM1 SNPrs488等位基因的C/C基因型患者的病死率明顯低于其他基因型患者（T/C、T/T），表明突變等位基因T會降低化療的效果。研究認為RRM1 RR524位點的亮氨酸突變成甘氨酸，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域發(fā)生改變，增加了DNA損傷修復(fù)能力，故而此類患者對鉑類化療藥物的敏感性明顯增加[14]。同時進一步分析發(fā)現(xiàn)RRM1及SOD2多態(tài)性間在化療敏感性方面存在明顯的相互作用，即：攜帶至少1個RRM1 RR524位點的C等位基因和SOD2 SNPrs4880位點的T等位基因的化療有效率明顯高于其他基因型攜帶者（P＜0.05）， 表明RRM1、SOD2基因多態(tài)性可能對臨床化療方案的制定具有指導(dǎo)意義。研究不足之處在于本研究例數(shù)較小，沒有對不同地域和民族患者深入分析。受樣本量限制，所以下一步研究應(yīng)該擴大樣本量和多樣性，以證實二者基因多態(tài)性是否能夠影響鉑類藥物治療晚期NSCC的療效。

表3 RRM1及S0D2聯(lián)合基因型與化療效果的關(guān)系(n)

綜上所述，RRM1、SOD2基因多態(tài)性可影響晚期NSCLC患者對以鉑類藥物為主方案的化療療效及生存率，二者可聯(lián)合應(yīng)用可預(yù)測化療療效，提示可根據(jù)患者基因型來指導(dǎo)個體化治療。