肖 莉，李丹鳳，石清明，何 甜，李瀾芯，聶 政

帕金森?。≒arkinson's disease,PD）是一種多因素的神經(jīng)退行性疾病，PD的病理特征是黑質(zhì)及紋狀體多巴胺（dopamin,DA）能神經(jīng)元死亡和變性，其病因尚不清楚，除線粒體功能異常、氧化應(yīng)激和α-synuclein蛋白的異常沉積外，神經(jīng)炎癥反應(yīng)已被證實(shí)可觸發(fā)和加重DA能神經(jīng)元的變性[1-2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，MMP-9促進(jìn)大腦炎性細(xì)胞（如小膠質(zhì)細(xì)胞）的激活，而激活的炎性細(xì)胞又加重了DA能神經(jīng)元的丟失[3-4]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，caspase-1可以切割白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的前體，促進(jìn)IL-1β 的成熟，IL-1β參與了帕金森病的發(fā)病過程[5-6]。硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)作為硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)供體，在體內(nèi)電離生成的HS-可與體內(nèi)H+結(jié)合生成H2S，對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導(dǎo)的PD小鼠DA能神經(jīng)元損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[7-9]。但其保護(hù)作用是否通過抑制MMP-9和caspase-1介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)尚未明確。本研究通過構(gòu)建小鼠PD模型，探討NaHS對PD小鼠紋狀體神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制，對PD的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級KM小鼠30只，18～20 g/只，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.1.2 主要試劑 NaHS（Sigma）；MPTP（aladdin）；羊抗兔IgG、GAPDH抗體（beyotime）；免疫組化試劑盒、caspase-1抗體、MMP-9抗體（boster）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及PD模型制備 將30只KM小鼠隨機(jī)分為病理組（MPTP組）、治療組（MPTP+NaHS組）和對照組（control組），每組10只。對3組小鼠進(jìn)行腹腔注射給藥，病理組小鼠注射MPTP[30 mg/(kg·d)]，治療組先注射NaHS[3 mg/kg·d）]，0.5 h后再注射MPTP[30 mg/(kg·d）]，對照組注射0.9%的生理鹽水。 注射后觀察并記錄小鼠行為變化，連續(xù)注射1 w后取材。

1.2.2 取材 10%水合氯醛麻醉，開顱取腦分離紋狀體，免疫印跡法檢測MMP-9、caspase-1的表達(dá)。4%的多聚甲醛固定腦組織用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2.3 HE染色 常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察和比較各組小鼠紋狀體形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 免疫組化染色 采用SABC法進(jìn)行MMP-9（1∶100）、caspase-1（1∶100）免疫組化染色，PBS代替一抗作陰性對照，10×40倍光鏡視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)MMP-9、caspase-1陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot 取出紋狀體加入裂解液，充分研磨后，取上清，蛋白定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育抗體，最后曝光。測定各組小鼠紋狀體MMP-9（1∶1000）、caspase-1（1∶1000）蛋白表達(dá)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21分析所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以x±s表示,各組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)和Tamhane's t2檢驗(yàn)。P＜0.05有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的行為學(xué)改變 病理組第一次腹腔注射MPTP約0.5 h后，小鼠出現(xiàn)不同程度的呼吸急促、全身輕度抽搐、攻擊、豎尾、抓鼻等癥狀，癥狀持續(xù)約10 min后逐漸減輕直至消失，最后一次注射后，對照組小鼠行為正常；治療組出現(xiàn)上述癥狀明顯較輕；病理組小鼠均在數(shù)分鐘內(nèi)產(chǎn)生上述癥狀。

2.2 HE染色結(jié)果 對照組紋狀體區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)正常，數(shù)量較多，排列整齊，間質(zhì)清晰。病理組神經(jīng)元數(shù)量減少，部分神經(jīng)元變性壞死、胞體紅染、排列紊亂，膠質(zhì)細(xì)胞增生。治療組神經(jīng)元缺失、發(fā)生變性壞死及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生程度較病理組明顯減輕，見圖1（箭頭所示為壞死神經(jīng)元）。

2.3 免疫組化檢測MMP-9表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，MMP-9在小鼠腦組織紋狀體區(qū)域主要表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)中，呈棕黃色。對照組（1.60±0.89）個(gè)幾乎未見MMP-9陽性細(xì)胞，病理組MMP-9（32.2±3.63）個(gè)較對照組明顯增多（P＜0.05），但細(xì)胞總數(shù)（包括正常細(xì)胞）減少。與病理組比較，治療組（13.20±1.30）個(gè)MMP-9的表達(dá)減弱,陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），但細(xì)胞數(shù)量相對增加，見圖2（箭頭所示為MMP-9陽性細(xì)胞）。

2.4 免疫組化檢測caspase-1表達(dá) 結(jié)果顯示，caspase-1在小鼠腦組織紋狀體區(qū)域主要表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)中，呈棕黃色。對照組陽性細(xì)胞數(shù)為（2.20±1.48）個(gè)，幾乎未見caspase-1陽性細(xì)胞，病理組caspase-1陽性細(xì)胞數(shù)為（27.40±1.52）個(gè)，較對照組明顯增多（P＜0.05），但細(xì)胞總數(shù)（包括正常細(xì)胞）減少。與病理組比較，治療組為（14.20±0.84）個(gè)，MMP-9的表達(dá)減弱，陽性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），但細(xì)胞數(shù)量相對增加，見圖3（箭頭所示為caspase-1陽性細(xì)胞）。

2.5 Western blot檢測MMP-9和caspase-1的表達(dá)Western blot結(jié)果對應(yīng)位置出現(xiàn)目標(biāo)蛋白（圖4）。MMP-9結(jié)果MPTP處理后，與對照組0.25±0.13相比，MPTP組1.17±0.17的表達(dá)量明顯增高（P＜0.05）。NaHS處理后，MPTP+NaHS組0.56±0.22蛋白表達(dá)量較MPTP組減少（P＜0.05）。Caspase-1檢測結(jié)果顯示，MPTP處理后，MPTP組1.15±0.03的蛋白量較對照組0.32±0.11明顯增高（P＜0.05）。NaHS處理后，MPTP+NaHS組0.63±0.14蛋白表達(dá)量較MPTP組減少（P＜0.05）。

3 討論

PD的病理特征是黑質(zhì)及紋狀體的DA能神經(jīng)元死亡變性，其損傷的原因尚未完全清楚，近年來，除了線粒體功能異常、氧化應(yīng)激和α-synuclein蛋白的異常沉積外，神經(jīng)炎癥也參與了PD的發(fā)病機(jī)制[10-11]。炎癥反應(yīng)可修復(fù)和清除機(jī)體有害物質(zhì)，神經(jīng)炎癥反應(yīng)也本應(yīng)如此，但由于神經(jīng)元一旦損傷便不可修復(fù)再生。所以，過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)抑制神經(jīng)元再生，也是引發(fā)PD及其他神經(jīng)變性疾病的關(guān)鍵[11]。 紋狀體的血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)對刺激具有高反應(yīng)性，MPTP可能誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β增多，使紋狀體的BBB通透性增加，紋狀體DA能神經(jīng)元丟失更加嚴(yán)重[12-13]。

MMP-9是一類由免疫細(xì)胞分泌的蛋白酶，遍及機(jī)體各種組織器官，降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，MMP-9雖然也可在正常人腦中被檢測到，但其表達(dá)處于基礎(chǔ)水平。但在病理?xiàng)l件下，如當(dāng)PD發(fā)生后，其表達(dá)大量增加。MPTP的代謝產(chǎn)物MPP+可使DA能神經(jīng)元變性，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)紋狀體MMP-9的活性[14-15]。Annese等[4]也證實(shí)，在注射MPTP后，黑質(zhì)和紋狀體MMP-9含量增加，MMP-9激活I(lǐng)L-1β和TNF-α等炎性介質(zhì)，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞的遷移和降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，增加BBB的通透性。在BBB血管側(cè)的內(nèi)皮細(xì)胞之間有提供結(jié)構(gòu)完整性的復(fù)合物，包括緊密連接[16]。MMP-9破壞緊密連接，使BBB的作用被削弱，加重神經(jīng)元丟失，同時(shí)炎性細(xì)胞向腦內(nèi)的遷移加重神經(jīng)元變性[7]。Caspase家族已被公認(rèn)參與PD病理過程，加重DA能神經(jīng)元的死亡，小膠質(zhì)細(xì)胞因此活化，從而誘發(fā)caspase-1釋放成熟的IL-1β和IL-18，這些炎癥介質(zhì)進(jìn)一步加重DA能神經(jīng)元的變性和MMP-9的釋放[15,17]。因此，caspase-1誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，加重PD[18-19]。

圖1 紋狀體區(qū)域的病理學(xué)變化（×400）

圖2 紋狀體MMP-9免疫組織化學(xué)結(jié)果（×400）

圖3 紋狀體caspase-1免疫組織化學(xué)結(jié)果（×400）

圖4 紋狀體MMP-9、caspase-1的蛋白水平

H2S是一種氣體遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)哺乳動物生物事件中發(fā)揮重要病理生理作用，可以抗炎，抑制氧化應(yīng)激，作為神經(jīng)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)[20]。NaHS可以作為H2S的供體，使神經(jīng)元免受MPP＋誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[21]。本研究通過建立小鼠PD病理模型，行為學(xué)改變提示NaHS預(yù)處理組能明顯改善MPTP所致的PD小鼠出現(xiàn)不同程度的呼吸急促、驚厥、攻擊、豎尾等癥狀。HE染色結(jié)果顯示病理組神經(jīng)元數(shù)量減少、排列紊亂、部分神經(jīng)元壞死及周圍見膠質(zhì)細(xì)胞增生。NaHS預(yù)處理組神經(jīng)元變性、丟失和神經(jīng)元排列紊亂程度較病理組明顯減輕。說明NaHS預(yù)處理組對PD小鼠紋狀體神經(jīng)元具有保護(hù)作用。各組小鼠大腦紋狀體區(qū)域MMP-9及caspase-1主要表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)中，免疫組化和WB結(jié)果顯示NaHS預(yù)處理組能顯著抑制PD小鼠紋狀體神經(jīng)元MMP-9的表達(dá)。此結(jié)果說明NaHS可能通過抑制MMP-9的表達(dá)，減少炎性介質(zhì)的釋放、抑制炎性細(xì)胞向腦內(nèi)的遷移浸潤和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解有關(guān)。免疫組化和WB結(jié)果顯示NaHS預(yù)處理組也可顯著降低PD小鼠紋狀體神經(jīng)元caspase-1的表達(dá)。說明NaHS可能通過下調(diào)caspase-1的表達(dá)，減少IL-1β和IL-18等炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕紋狀體神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，NaHS對MPTP所致PD小鼠紋狀體具有保護(hù)作用。此作用可能通過抑制caspase-1的激活從而減少IL-1β和IL-18等炎癥介質(zhì)的釋放，下調(diào)下游的MMP-9，對神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)起到緩解作用，從而減少紋狀體區(qū)DA能神經(jīng)元變性和丟失有關(guān)。