洪小蘭，吳海麗，謝彩麗，沈翠蓉，錢(qián) 江

黑色素瘤(melanoma)是一種源于皮膚、黏膜、眼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)色素沉著區(qū)域的黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，其惡性程度高，預(yù)后極差。超過(guò)95%的黑色素瘤發(fā)生在皮膚，稱(chēng)為皮膚惡性黑瘤（malignant melanoma，MM）[1-2]。由于MM對(duì)化療或放療不敏感，Ⅳ期黑色素瘤患者的5年相對(duì)生存率顯著下降到10%[3-5]。因此，開(kāi)發(fā)MM早期診斷及治療的新靶點(diǎn)對(duì)提高皮膚黑色素瘤患者預(yù)后具有十分重要的意義。近年來(lái)，隨著對(duì)皮膚黑色素瘤的深入研究，許多有效抑制MM生長(zhǎng)和擴(kuò)散的關(guān)鍵分子被鑒定出來(lái)，針對(duì)這些關(guān)鍵分子開(kāi)發(fā)的靶向治療和免疫治療也取得了顯著的治療效果，預(yù)示了這一類(lèi)藥物的應(yīng)用前景[6-8]。

NRP-1是一種多功能的非酪氨酸激酶受體，可作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growthfactor,VEGF）和軸突導(dǎo)向因子3(Semaphorin3,Sema3)的共受體，在血管生成，軸突引導(dǎo)，細(xì)胞存活，遷移和侵襲中發(fā)揮著多種作用[9-13]。相關(guān)研究提示，NRP-1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，包括腦癌[14]，前列腺癌[15]，乳腺癌[16]，結(jié)腸癌[17]和肺癌[18]，并且NRP-1的表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)。然而，NRP-1在黑色素瘤中的表達(dá)及其作用的研究較少。本研究目的是探討NRP-1在4種人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)及在人皮黑色素細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)。此外，為進(jìn)一步探討NRP-1對(duì)皮膚黑色素瘤的作用，本研究采用NRP-1單克隆抗體抑制NRP-1功能后探究NRP-1對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株SK-MEL-1，WM115，A-375，G361和人正常皮膚黑色素細(xì)胞株P(guān)IG1均購(gòu)買(mǎi)于北京中源合聚生物科技公司。上述細(xì)胞均使用10%FBS和1%鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 主要試劑與材料 組織芯片（含6例人正常皮膚組織與12例皮膚黑色素瘤組織）購(gòu)買(mǎi)于中科光華(西安)智能生物科技有限公司；鼠源性NRP-1單克隆抗體與β-actin單克隆抗體購(gòu)買(mǎi)于廈門(mén)閩博生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記兔抗鼠抗體購(gòu)買(mǎi)于廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司；CCK-8試劑盒、免疫組化染色試劑盒購(gòu)買(mǎi)于上海生工生物工程股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific）；胎牛血清（GIBCO）；全蛋白提取試劑盒購(gòu)買(mǎi)于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 蛋白免疫印跡 （Western blot） 參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[19]，將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取裂解，離心后收集上清液。加入4×上樣緩沖液煮沸5 min，于4℃條件下保存。采用12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。室溫封閉（5%脫脂奶粉的TBS封閉液）1 h后，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗3遍，每遍10 min，加入熒光標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，用TBST洗3遍后，滴加化學(xué)發(fā)光劑溶液（ECL）顯影液在顯影儀上進(jìn)行顯影。

1.4 免疫組化染色與評(píng)分 免疫組化染色參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[20]，將石蠟切片至于60℃烘箱放置1 h后進(jìn)行脫蠟、水化。脫蠟后，將浸入0.01 M枸櫞酸緩沖液（pH 6.0），置入微波爐中加熱10 min，進(jìn)行抗原修復(fù)。進(jìn)一步在組織切片上滴加3%過(guò)氧化氫溶液以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。最后分別加入鼠源性NRP-1單克隆抗體（一抗）和HRP標(biāo)記兔抗鼠抗體（二抗）進(jìn)行孵育，最后用免疫組化試劑盒對(duì)切片進(jìn)行染色處理。免疫組化評(píng)分采用積分綜合計(jì)量法，即NRP-1的表達(dá)指數(shù)=染色強(qiáng)度×染色細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)。

1.5 NRP-1單克隆抗體對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響 取指數(shù)生長(zhǎng)期的SK-MEL-1細(xì)胞稀釋至10×105/ml，轉(zhuǎn)移至12孔板于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。本研究將細(xì)胞進(jìn)行以下分組并做相應(yīng)處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔：（1）空白對(duì)照組：不做任何處理；（2）低濃度抗體組：加入20μl的1μg/ml濃度的NRP-1單克隆抗體；（3）中濃度抗體組：加入20μl的500μg/ml濃度的NRP-1單克隆抗體；（4）高濃度抗體組：加入20μl的1 mg/ml濃度的NRP-1單克隆抗體；分別在6 h、12 h、24 h和48 h，利用CCK-8試劑盒對(duì)各濃度抗體處理組進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞相對(duì)增殖活性=抗體處理組細(xì)胞數(shù)/空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù) ×100%。參考上述的分組與處理，在培養(yǎng)48 h后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NRP-1在4種皮膚黑色素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示，NRP-1在4種人黑色素瘤細(xì)胞株（SK-MEL-1，WM115，A-375，G361）中的表達(dá)量均明顯高于人正常皮膚黑色素細(xì)胞株P(guān)IG1中的表達(dá)量（圖1），以?xún)?nèi)參蛋白β-actin為對(duì)照，對(duì)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的Western blot結(jié)果做半定量分析，結(jié)果（表1）顯示，NRP-1在4種人黑色素瘤細(xì)胞株SKMEL-1，WM115，A-375和G361的相對(duì)表達(dá)量均較正常人皮膚黑色素細(xì)胞株P(guān)IG1高（P＜0.05）。其中，NRP-1在SK-MEL-1中的相對(duì)表達(dá)量最高，是在PIG1細(xì)胞株中的表達(dá)量的14.7倍。

2.2 NRP-1在皮膚黑色素瘤組織中的表達(dá) 含6例人正常皮膚組織與12例皮膚黑色素瘤組織的組織芯片的免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖2，NRP-1在6例正常皮膚組織表達(dá)量較低或無(wú)表達(dá)；而在12例皮膚黑色素瘤組織中均能檢測(cè)到明顯的NRP-1表達(dá)，呈淺棕黃色或深褐色。

2.3 NRP-1單克隆抗體對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果見(jiàn)圖3，低、中、高濃度組的細(xì)胞相對(duì)增殖活性均＜100%，即低、中、高濃度的NRP-1單克隆抗體均對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，NRP-1對(duì)細(xì)胞增值的抑制效果越明顯。值得注意的是，NRP-1單克隆抗體處理48 h后，不同濃度抗體處理組的細(xì)胞相對(duì)增殖活性有顯著差異，表現(xiàn)為低濃度組的細(xì)胞相對(duì)增殖活性大于中濃度組的細(xì)胞相對(duì)增殖活性，中濃度組的細(xì)胞相對(duì)增殖活性大于高濃度組的細(xì)胞相對(duì)增殖活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 免疫組化檢測(cè)NRP-1在人正常皮膚組織與皮膚黑色素瘤組織中的表達(dá)（標(biāo)尺=50μM）

2.4 NRP-1單克隆抗體對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響 典型的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果見(jiàn)圖4A，NRP-1抗體組的凋亡（Q2區(qū)）細(xì)胞數(shù)明顯較PBS組多，且隨著NRP-1抗體濃度的增加，細(xì)胞凋亡數(shù)也隨之增加。對(duì)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)做定量分析，結(jié)果見(jiàn)圖4B，PBS組的細(xì)胞凋亡率為（1.43±0.15）%，低濃度組細(xì)胞凋亡率為 （5.57±1.44）%；中濃度組細(xì)胞凋亡率為（13.86±3.84）%， 高濃度組細(xì)胞凋亡率為（36.03±7.51）%。抗體處理組的細(xì)胞凋亡率均較PBS組高（P＜0.05）,且隨NRP-1單克隆抗體濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率也隨之增加（P＜0.05）。

3 討論

皮膚黑色素瘤對(duì)常規(guī)的放療、化療均不敏感。近年來(lái)，隨著對(duì)皮膚黑色素瘤分子機(jī)制研究的深入，靶向治療和免疫治療已成為治療皮膚黑色素瘤的一種很有前途的治療方法。2014年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了首個(gè)PD-1單克隆抗體用于晚期皮膚黑色素瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)。PD-1單克隆抗體的治療獲益率超過(guò)30%，晚期皮膚黑色素率的生存率明顯增加。1，2，3年生存率分別為62%、44%及40%[21]。 篩選可用于靶向治療或免疫治療的靶點(diǎn)是提高皮膚黑色素瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵。NRP-1是一種很有前途的腫瘤治療靶點(diǎn)，被證實(shí)與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，是近年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

本研究首先利用Western blot檢測(cè)了4株人皮膚 黑 色 素 細(xì) 胞 瘤 細(xì) 胞 （SK-MEL-1，WM115，A-375，G361）和人正常皮膚黑色素細(xì)胞株P(guān)IG1細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果提示（圖1），NRP-1在人正常皮膚黑色素細(xì)胞中表達(dá)量較低。與正常皮膚黑色素細(xì)胞相比，4株黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞的NRP-1表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)。其中，在SK-MEL-1和WM115細(xì)胞中表達(dá)最高。組織芯片的免疫組化結(jié)果（圖2）與Western blot檢測(cè)結(jié)果相符。在人正常皮膚組織中，NRP-1蛋白的表達(dá)量極低，幾乎檢測(cè)不到NRP-1的表達(dá)。而在人黑色素細(xì)胞瘤組織中均能檢測(cè)到NRP-1蛋白的高度表達(dá)。上述結(jié)果提示，NRP-1在皮膚黑色素瘤中的表達(dá)較正常皮膚組織有顯著上調(diào)。因此，NRP-1或是一個(gè)皮膚黑色素瘤診斷或治療的有潛力的分子靶標(biāo)。接著，本課題初步研究NRP-1單克隆抑制NRP-1功能后對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用。結(jié)果提示（圖3），NRP-1單克隆抗體能顯著抑制人皮膚黑色素細(xì)胞瘤SK-MEL-1細(xì)胞株的增殖。且這種細(xì)胞增殖抑制作用與抗體的濃度有關(guān)。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)研究提示（圖4），NRP-1單克隆抗體也能促進(jìn)SK-MEL-1細(xì)胞株的細(xì)胞凋亡。呂莎等[26]的研究提示，NRP-1單克隆抗體可通過(guò)PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化來(lái)抑制細(xì)胞增殖和遷移，并通過(guò)Bcl-2/Bax/Caspase3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。該研究結(jié)果與本研究的相符。

圖1 Western blot檢測(cè)NRP-1在4種皮膚黑色素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)

圖3 NRP-1單克隆抗體對(duì)皮膚黑色素瘤SK-ME-1細(xì)胞增殖的影響

圖4 NRP-1單克隆抗體對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞凋亡的影響

本研究初步確定了NRP-1在皮膚黑色素瘤中有高表達(dá)，且NRP-1單克隆抗體可顯著抑制皮膚黑色素瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)皮膚黑色素瘤細(xì)胞的凋亡。因此推測(cè)，NRP-1或是皮膚黑色素瘤的一個(gè)重要治療靶點(diǎn)。后期可深入探討NRP-1單克隆抗體抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，或進(jìn)一步在小鼠模型中評(píng)估NRP-1單克隆抗體在體內(nèi)的腫瘤抑制作用。