孫永剛，桂林生，吳森，韓銀倉

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 青海省高原家畜遺傳資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室，西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

牦牛是青藏高原及毗鄰地區(qū)集役、肉、奶、皮、絨等為一體的特有畜種，我國牦牛存欄數(shù)約1400萬頭，占世界存欄總數(shù)的95%以上，青海省又是第一牦牛大省，有牦牛500萬頭，占牦?？倲?shù)的37.7%，是牧民生產(chǎn)和生活資料的主要來源[1]，牦牛乳不僅是牦牛犢生存的必需品，也是牧民日常生活的主要食品之一，牦牛乳與普通牛乳相比其營養(yǎng)價值更為豐富，脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、維生素、礦物質(zhì)及必需氨基酸等營養(yǎng)素含量均高于普通牛乳[2]，其中牦牛乳蛋白含量高達4.0g/100g，鈣含量高達132mg/100g，共軛亞油酸含量占總脂肪酸的0.92%，高于普通牛乳(0.40%～0.79%)，另外牦牛乳還有低致敏性，鈣磷比為1.72∶1，多種活性生長因子等特點[3]。

乙酰輔酶 A 羧化酶 α(acetyl-CoA carboxylases alpha,ACACA) 是ACACA基因編碼的脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵限速酶，在脂肪酸代謝過程中起到重要調(diào)控作用，主要在脂肪生成活躍的組織表達，如肝臟、脂肪組織和乳腺。牛的ACACA基因位于第19號染色體q13-q14上，基因全長約 289k bp，包含56個外顯子和55個內(nèi)含子[4]。目前，有關(guān)ACACA基因的結(jié)構(gòu)、功能及表達調(diào)控等方面都有報道，研究表明，ACACA基因突變影響畜禽乳、肉品質(zhì)性狀及乳中脂肪酸組成，西班牙Churr綿羊ACACA基因15個SNPs顯著影響乳中脂肪酸的組成，4個SNPs顯著影響乳蛋白率和乳脂率[5]，山羊第45外顯子C-T突變對乳脂量和乳糖量都存在差異[6]，嶗山奶山羊ACACA基因啟動子PⅢ位點突變?nèi)榈鞍茁?、乳糖率、乳密度?05d產(chǎn)奶量存在不同程度的影響[7]。荷斯坦奶牛和綿羊ACACA基因位點突變顯著改變?nèi)橹兄舅岷縖8,9]。ACACA基因g.2274G>A位點突變與韓牛眼肌面積呈顯著性相關(guān)[10]。

本試驗利用DNA測序技術(shù)分析ACACA基因的多態(tài)性，通過生物統(tǒng)計學(xué)軟件，對多態(tài)位點基因頻率、基因型頻率、平衡性、群體遺傳性及牦牛泌乳性狀的相關(guān)性進行了統(tǒng)計分析。篩選出了對牦牛泌乳性狀有重要影響的功能基因和分子標(biāo)記，以期為牦牛的育種提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料采集及泌乳性狀指標(biāo)檢測

血樣采自青海省海北州祁連縣默勒鎮(zhèn)和野牛溝鄉(xiāng)，隨機選擇健康的產(chǎn)乳牦牛235頭，頸靜脈采血10 mL，并采集乳樣，樣品采集完畢后置于-80℃ 保存，然后使用TIANamp Blood DNA kit試劑盒(天根，北京)進行DNA提取。

1.2 牦牛ACACA基因PCR擴增

根據(jù)GenBank 公布的牛ACACA(AC-000176.1),利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計引物(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負責(zé)合成。

PCR反應(yīng)體系30.0μL，包括：含有核酸染料的dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×Buffer的Mix 15.0μL，ddH2O 11.8μL，上游、下游引物各(10pmol/μL)0.6μL、模板DNA(50ng/μL)2.0μL。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min；94℃30s，64.5℃退火30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 SNP檢測

將擴增好的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行純化并測序，測序結(jié)果使用Seqman軟件進行對比分析，尋找突變位點。

表1 引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)基因型統(tǒng)計分析結(jié)果計算基因型、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、遺傳雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)，并進行Hard-Weinberg平衡適應(yīng)性檢驗。同時，使用HAPLOVIEW3.32軟件對ACACA基因2個SNP位點進行連鎖不平衡分析及單倍型分析。采用SPSS17.0軟件中的GLM分別對ACACA基因的SNP位點的基因型與高原型牦牛泌乳性狀(乳蛋白率、乳脂率和乳糖率)進行相關(guān)性分析，采用鄧肯法 (Duncan’s) 進行均數(shù)間的多重比較。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (X±SE) 表述，以P<0.05 為差異顯著水平。具體分析模型如下：表型觀察值=群體均值+基因型效應(yīng)+胎次效應(yīng)+季節(jié)效應(yīng)+隨機誤差。

2 結(jié)果

2.1 ACACA基因多態(tài)位點的遺傳學(xué)分析

牛ACACA基因位于第19號染色體上，基因全長289257 bp，含56個外顯子。通過測序分析發(fā)現(xiàn)，ACACA基因5’UTR上存在2個SNP，分別命名為g.43478T>A(圖1-A)和g.43569C>T(圖1-B)。

圖1 (A)g.43478T>A基因型測序圖 (B)g.43569C>T基因型測序圖

如表2所示，本研究分析了這2個SNP位點的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量的遺傳指標(biāo)，并進行卡方檢驗檢測Hardy Weinberg平衡狀態(tài)。結(jié)果顯示，ACACA基因g.43478T>A處，TT為優(yōu)勢基因型，而CC是g.43569C>T的優(yōu)勢基因型?？ǚ綑z驗表明，這兩個突變位點均處于Hardy Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，且為中度多態(tài)(0.50>PIC>0.25)。

表2 ACACA基因突變位點多態(tài)信息

2.2 ACACA基因SNP位點的不同基因型對高原型牦牛泌乳性狀的影響

將235頭高原型牦牛的3個泌乳性狀分別與ACACA基因突變位點的基因型進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示(表3)，g.43478T>A位點上的AA基因型泌乳性狀表現(xiàn)最優(yōu)，乳脂率均值極顯著高于TT基因型(P<0.01)，而乳蛋白率均值則顯著高于TT基因型均值(P<0.01)。g.43569C>T位點上的不同基因型的泌乳性狀差異不顯著(P>0.05)。

表3 ACACA基因突變位點與泌乳性狀關(guān)聯(lián)性分析

2.3 ACACA基因SNP位點的單倍型和連鎖不平衡分析

通過軟件對ACACA基因上2個SNP位點進行單倍型分析，總共檢測到4種單倍型，分別為Hap1-Hap4(表4)。其中單倍型Hap1的發(fā)生頻率最高，達到0.503，其次為單倍型Hap2和單倍型Hap3，發(fā)生頻率分別為0.207和0.169。

表4 ACACA基因突變位點單倍型分析

此外，通過連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，這2個SNP位點兩兩間的r2值小于0.330(表5)。基于r2值大于0.330，反映兩者間具有較強的連鎖不平衡效應(yīng)的原則，因此，本文發(fā)現(xiàn)的2個SNP位點間不存在強的連鎖性。

表5 ACACA基因突變位點連鎖不平衡分析

2.4 ACACA基因SNP位點雙倍型對高原型牦牛泌乳性狀的影響

經(jīng)分析得出，ACACA基因中2個SNP位點共有12種雙倍型，將發(fā)生頻率低于5%的7種合并基因型定義為其它類型，并進行刪除(表6)。將其余的雙倍型進行關(guān)聯(lián)性分析后發(fā)現(xiàn)，雙倍型H2H2個體的乳脂率極顯著高于雙倍型H1H1(P<0.01)，并且顯著高于雙倍型個體H1H2和H1H2(P<0.05)。因此，在本試驗群體中，雙倍型H2H2可被視為一種最為優(yōu)秀的雙倍型。

表6 ACACA基因突變位點雙倍型與泌乳性狀關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

ACACA基因作為影響畜禽乳、肉品質(zhì)性狀及脂肪酸組成的重要候選基因，是脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵限速酶，在脂肪酸代謝過程中起到重要調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)高原型牦牛ACACA基因5’UTR上存在2個SNP位點，分別為g.43478T>A和g.43569C>T，兩個突變位點均處于Hardy Weinberg平衡狀態(tài)，ACACA基因g.43478T>A處，TT型為優(yōu)勢基因型， g.43569C>T處CC型為優(yōu)勢基因型。將高原型牦牛的3個泌乳性狀分別與ACACA基因突變位點的基因型進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，g.43478T>A位點上的AA基因型泌乳性狀表現(xiàn)最優(yōu)，乳脂率和乳蛋白率均極顯著高于TT基因型(P<0.01)；g.43569C>T位點上的不同基因型的泌乳性狀差異不顯著(P>0.05)。對兩個位點進行單倍型和連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)存在4種單倍型，但是2個SNP位點間不存在強的連鎖性(r2=0.027)。進一步分析雙倍型發(fā)現(xiàn)H2H2個體的乳脂率極顯著高于其他類型雙倍型(P<0.01)，不同雙倍型之間乳蛋白率和乳糖率差異不顯著(P>0.05)。因此，在本試驗群體中，雙倍型H2H2可被視為一種最為優(yōu)秀的雙倍型。在中國荷斯坦奶牛ACACA基因片段檢測到g.43569T>C 和g.43617T>G 2個SNPs 位點，其顯著影響中國荷斯坦奶牛的乳脂率，特別是H1H1(CG-CG)雙倍型個體，其乳脂率顯著高于其他雙倍型個體[11]，該研究結(jié)果與本試驗結(jié)果接近。甘南牦牛ACACA基因 PI和PIA 啟動子區(qū)域位點突變影響乳脂率、乳蛋白率、乳脂肪酸含量、總固體物質(zhì)含量及肌肉剪切力、熟肉率和失水率[12]。通過干擾奶牛PPARG基因后，ACACA基因表達水平和乳脂含量減少；過表達奶牛PPARG基因后，ACACA基因表達水平和乳脂隨之升高[13]。綿羊ACACA基因啟動子PIII 位點突變與乳脂含量呈顯著相關(guān)性[9]，嶗山奶山羊ACACA基因啟動子PⅢ序列3個SNPs(第1206 位的B/D，1255 位的A/C 和1322 位的M/N)位點突變均對泌乳母羊的乳蛋白率、乳糖率、非脂肪物、乳密度、產(chǎn)奶量產(chǎn)生影響[14]。意大利當(dāng)?shù)厣窖蚝退_能奶山羊ACACA基因PⅢ啟動子位點突變與山羊乳脂率呈正相關(guān)[15]。

本研究結(jié)果表明，ACACA基因?qū)Ω咴完笈Ｃ谌樾誀钣幸欢ǖ挠绊?，可以作為?biāo)記輔助選擇的候選基因，通過標(biāo)記輔助選擇和標(biāo)記輔助導(dǎo)入技術(shù)指導(dǎo)牦牛的育種改良，縮短育種周期，對加快牦牛業(yè)的發(fā)展有重要的理論意義。