陳生梅，馬志杰，李瑞哲，尕布藏，李文浩，艾德強

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 青海省高原家畜遺傳資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室，西寧 810016；2.青海省門源縣蘇吉灘鄉(xiāng)獸醫(yī)站，門源 810399；3.青海省畜牧總站，西寧 810008)

牦牛是分布在青藏高原及其毗鄰高地的特色牛種，中國現(xiàn)有牦牛2200多萬頭，是世界上擁有牦牛數(shù)量和品種(類群)最多的國家[1]。白牦牛主要分布于我國甘肅省天?？h以及青海省門源縣、大通縣及互助縣[2]，是特有的牦牛經(jīng)濟類型和種質(zhì)資源，享有“草原白珍珠”的美稱。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)D-loop區(qū)序列具有豐富的遺傳變異，近年來已被廣泛用于牦牛的起源、分化及遺傳多樣性評估等研究[3]。Lai等[4]基于D-loop區(qū)和Cyt b基因部分序列對4個中國牦牛品種(包括天祝、九龍、麥洼和西藏高山牦牛)遺傳多樣性和起源馴化進行分析，表明各牦牛品種具有豐富的遺傳多樣性，推測中國牦牛起源于同一祖先，可能有2個主要的馴化點。郭松長等[5,6]基于D-loop區(qū)部分序列對10個我國家牦牛品種(即天祝、大通和環(huán)湖牦牛等)和1個野牦牛群體遺傳多樣性、分化和聚類關(guān)系等進行綜合分析，表明野、家牦牛都具有豐富的遺傳多樣性，但野牦牛遺傳多樣性較高；牦牛擁有2個聚類簇，推測有2個母系起源；家牦牛品種(類群)間存在顯著的遺傳分化，但僅存在少數(shù)品種(類群)之間；支持將我國家牦牛劃分為橫斷高山型和青藏高原型2大類型的觀點。Wang等[7]對包括天祝、甘南和野牦牛等品種(群體)的452頭D-loop區(qū)以及72頭個體mtDNA全序列和蛋白編碼序列綜合分析表明，野牦牛的遺傳多樣性高于家牦牛，共檢測到3個高度分化的遺傳分支，其中2大主要分支在家、野牦牛中都有分布，第3個分支只包含較少野牦牛個體；3大分支分化時間估計在42～58萬年；家牦牛分支的非同義突變率顯著地高于野牦牛；家牦牛沒有明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。成述儒等[8]對甘肅6個牦牛群體遺傳多樣性和聚類關(guān)系分析表明，3個群體(即瑪曲、碌曲和夏河群體)具有較豐富的遺傳多樣性，而天祝白牦牛遺傳多樣性較低，推測甘肅牦?？赡苡?個母系起源。Yue等[9]對235頭天祝白牦牛D-loop序列進行綜合分析，共確定47種單倍型，核苷酸多樣度和單倍型多樣度分別為0.023±0.001和0.944±0.008，表明天祝白牦牛具有較高的遺傳多樣性水平。李靜等[10]為明確喀喇昆侖—帕米爾地區(qū)牦牛的遺傳多樣性水平、分化和系統(tǒng)進化地位，對該地區(qū)156頭牦牛D-loop區(qū)進行序列測定并與510條已發(fā)表的家、野牦牛品種(群體)(包括天祝白牦牛)相應(yīng)序列進行比對分析，結(jié)果顯示喀喇昆侖—帕米爾地區(qū)牦牛平均單倍型多樣度為0.806，核苷酸多樣度為0.015，表明該地區(qū)牦牛群體遺傳多樣性豐富；系統(tǒng)發(fā)育聚類分析顯示其有2大分支，推測其擁有2個不同的母系起源，具有較獨特的遺傳背景。

從上述研究可以看出，當(dāng)前基于mtDNA D-loop序列對我國白牦牛母系遺傳的研究僅限于天祝白牦牛[4-10]，而對青海省門源白牦牛母系遺傳多樣性的分子評估研究尚未見報道。鑒于此，本研究對青海省門源縣白牦牛的mtDNA D-loop區(qū)序列進行測定和比對分析，揭示其母系遺傳多樣性及其遺傳背景，為其種質(zhì)資源的合理開發(fā)和保護利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

在青海省門源縣蘇吉灘鄉(xiāng)隨機采集31頭白牦牛的頸靜脈血樣，EDTA抗凝后帶回實驗室冷凍保存?zhèn)溆?。使用全血基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司提供)提取基因組DNA，操作步驟按說明書進行。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成、PCR擴增與測序

采用馬志杰等[11]使用的引物來擴增門源白牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列，其中上游引物(PF)為5'-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3'，下游引物(PR)為5'-GGGGTGTAGATGCTTGC-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(25 μL): 5×Prime STAR Buffer 5μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.3 μL，上、下游引物(10pmol/L)各1 μL，基因組DNA1μL，超純水16.7 μL。PCR反應(yīng)程序: 98℃變性10s，62℃退火15s，72℃延伸1min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳并進行凝膠成像分析，后送PCR純化產(chǎn)物到上海生工生物工程股份有限公司進行正、反向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

測序結(jié)果采用Bioedit 7.2.5軟件[12]進行序列比對及人工校對，以確保測序結(jié)果的準確性。用Dnasp 5.10.01軟件[13]確定核苷酸序列多態(tài)位點和單倍型數(shù)目，Arlequin 3.11軟件[14]用于計算序列單倍型多樣度和核苷酸多樣度大小，以揭示門源白牦牛的遺傳多樣性豐富程度。使用MEGA5.05軟件[15]中的鄰接法(即NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹開展不同單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育分析，以揭示其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 門源白牦牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性分析

通過測定31頭青海省門源白牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列，得到序列長度為892～896bp，排除5處插入或缺失位點后共發(fā)現(xiàn)38處多態(tài)位點(圖1)，占分析序列總長度的4.24%。其中，38處多態(tài)位點中有24處為單一多態(tài)位點，分別為135、142、188、194、256、276、293、309、310、317、326、334、356、391、501、539、694、697、720、731、771、810、813和851位點，占序列總長度的2.68%；14處為簡約信息位點(即1、173、230、248、249、257、267、296、314、315、398、495、709和884位點)，占序列總長度的1.56%。序列核苷酸頻率統(tǒng)計分析表明，C、T、A和G的平均含量分別為25.36%、28.47%、32.27%和13.90%，C+G的平均含量(39.26%)顯著低于A+T的平均含量(60.74%)，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏倚性。

圖1 門源白牦牛mtDNA D-loop區(qū)13種單倍型頻率分布及其核苷酸變異

根據(jù)序列間核苷酸遺傳變異，31頭門源白牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列比對分析共確定了13種單倍型，其中單倍型H2由7個個體共享，單倍型H1和H3均由5個個體共享，單倍型H10由3個個體共享，單倍型H6和H11均由2個個體共享，其余的單倍型均由一個體擁有(圖1)。計算分析結(jié)果表明，序列平均核苷酸差異數(shù)K值為5.17，而單倍型多樣度為0.901±0.030，核苷酸多樣度為0.006±0.004。

2.2 門源白牦牛系統(tǒng)發(fā)育分析

以普通牛(GenBankNo:AF492351)為外群，對13種青海省門源白牦牛mtDNA D-loop區(qū)單倍型序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，13種單倍型在系統(tǒng)發(fā)育樹中分為明顯的2個支系，其中H13單倍型為單獨的1支(即支系Ⅱ)，其余12種單倍型聚為另一支(即支系Ⅰ)。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)，也是生命進化和物種分化的前提，更是評價自然生物資源的重要依據(jù)。家畜遺傳多樣性水平通常以單倍型多樣度為主要衡量依據(jù)。當(dāng)前，國內(nèi)對白牦牛母系遺傳多樣性的研究主要是針對甘肅省天祝白牦牛品種而開展的。如在先前的研究中，Lai等[4]對13頭天祝白牦牛進行D-loop區(qū)分析表明，其單倍型多樣度為0.923±0.057。郭松長等[5]對23條天祝白牦牛D-loop序列分析得出該品種單倍型多樣度為0.930±0.030。成述儒等[8]對40頭天祝白牦牛D-loop區(qū)的分析表明單倍型多樣度為0.662±0.031。而Yue等[9]對235條天祝白牦牛D-loop序列分析顯示其單倍型多樣度為0.944±0.008?？梢钥闯?，甘肅省天祝白牦牛品種的單倍型多樣度大小在0.662～0.944之間，其值大小不同可能主要與不同研究者所使用的樣本量、采樣群體不同及所分析序列的長度不同等因素相關(guān)。而在本研究中，青海省門源白牦牛的單倍型多樣度大小為0.901±0.030，其值雖小于Yue等[9]基于大樣本量計算得出的天祝白牦牛單倍型多樣度值，但較接近該值，說明門源白牦牛也具有豐富的母系遺傳多樣性，但其遺傳多樣性水平低于天祝白牦牛。就2個白牦牛品種(群體)間的遺傳多樣性差異緣由，推測可能與其選育程度、群體結(jié)構(gòu)組成、生境環(huán)境不同等因素相關(guān)，其具體的深層次遺傳差異及其原因，有待今后進一步開展深入研究。

圖2 基于NJ法構(gòu)建的門源白牦牛13種mtDNA D-loop區(qū)單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹

家畜的起源和系統(tǒng)發(fā)育分析有助于揭示不同物種間的遺傳差異、進化歷史和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等，對保護和充分開發(fā)利用家畜遺傳資源具有重要意義。在先前的研究中，分析表明我國家牦牛具有2個母系起源[4,5,7-10]。在本研究中，聚類分析結(jié)果顯示青海省門源白牦牛13種單倍型聚為2支，提示其也有2個母系起源，這與前人對其他家牦牛品種(群體)的研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究表明門源白牦牛具有較豐富的母系遺傳多樣性，由2個母系遺傳分支組成，具有2個母系起源。