牛志偉，汪曉璐，徐文競，劉愛峰，李豪圣，李洪振，韓冉，劉成，劉建軍

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／小麥玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264000；3.武城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 武城 253300）

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾娜蠹Z食作物之一，其因出色的加工特性受到人類的青睞。小麥面粉常被加工成面包、饅頭和面條等，為人們提供了主要能量和營養(yǎng)。Osborne［1］根據(jù)溶解特性將小麥籽粒蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白4種類型，其中醇溶蛋白和麥谷蛋白統(tǒng)稱為面筋蛋白，約占小麥總蛋白的80%～85%，是小麥面筋的主要成分，決定著小麥的品質(zhì)特性［2］。小麥醇溶蛋白根據(jù)在酸性聚丙烯酰胺凝膠中遷移率分為α、β、γ和ω4種類型，其中，α和β類醇溶蛋白存在結(jié)構(gòu)同源性，往往被統(tǒng)稱為α類醇溶蛋白［3］。醇溶蛋白主要影響面團(tuán)的延展性和黏性［4］。麥谷蛋白根據(jù)分子量大小可分為高分子量麥谷蛋白（HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白（LMW-GS）。其中低分子量麥谷蛋白占全部麥谷蛋白的60%，決定著面團(tuán)的強(qiáng)度和粘度，對面粉的加工品質(zhì)起著重要作用［5］。

乳糜瀉（celiac disease，CD）是一種自身免疫性疾病，是因攝入小麥、大麥或黑麥中的面筋蛋白而引發(fā)的慢性小腸炎癥性疾病，該病由Th1型細(xì)胞（T helper cell 1，Th1）介導(dǎo)并具有基因易感性。小麥α-和γ-醇溶蛋白內(nèi)存在多種肽段與CD誘發(fā)有關(guān)。迄今為止，已經(jīng)從普通小麥及其近緣物種中檢測到31種具有免疫活性的致乳糜瀉表位［6］，由9個(gè)核心區(qū)氨基酸組成。其中有5個(gè)高頻率免疫活性的抗原表位［7］，分別是DQ2.5-gliaγ1（PQQSFPEQQ）、DQ2.5-glia-α1（PFPQPQLPY）、DQ2.5-glia-α2（PQPQLPYPQ）、DQ2.5-glia-α3（FRPQQPYPQ）和DQ8-gliaα1（QGSFQPSQQ）。

濟(jì)南17、濟(jì)麥229和濟(jì)麥262的高分子量麥谷蛋白亞基分別為（1、7＋8和4＋12）、（1、7＋8和5＋10）和（1、4＋15和2＋12）。但是，三個(gè)品種的低分子量麥谷蛋白和醇溶蛋白尚未有相關(guān)信息。鑒于此，本研究對上述品種的低分子量麥谷蛋白和醇溶蛋白基因進(jìn)行克隆和序列分析，以期發(fā)掘新的面筋蛋白等位基因，同時(shí)為小麥加工品質(zhì)的分子改良提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種濟(jì)南17和濟(jì)麥229以及抗旱節(jié)水小麥新品種濟(jì)麥262，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所小麥遺傳育種團(tuán)隊(duì)育成并提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 小麥基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)［8］。

1.2.2 低分子量麥谷蛋白、α-和γ-醇溶蛋白基因克隆 利用表1引物對三個(gè)小麥品種的低分子量麥谷蛋白、α-和γ-醇溶蛋白基因進(jìn)行克隆。

表1 基因克隆所需引物

PCR反應(yīng)體系為50μL，含有DNA模板50 ng，4種dNTP各200μmol·L-1，2×GC BufferⅠ25μL，上下游引物各0.2μmol·L-1，2.5 U Fastpfu DNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，55～65℃退火20 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對目的片段進(jìn)行切膠回收和純化，純化產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落并通過菌落PCR鑒定陽性克隆，送青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 序列分析、CD毒性肽識(shí)別和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

用DNAMAN軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析和氨基酸序列預(yù)測。根據(jù)van Herpen等［13］的方法識(shí)別克隆基因所編碼的5種主要的T-細(xì)胞毒性抗原表位，同時(shí)分析LGQGSFRPSQQN和LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽的分布［14］。在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)序列，用MEGA 6.0軟件（Neighbor-Joining法）構(gòu)建麥谷蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 低分子量麥谷蛋白的克隆及序列分析

利用Glu-A3F／R、Glu-B3F／R、Glu-D3F／R三對引物對濟(jì)南17、濟(jì)麥262和濟(jì)麥229基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1A）并測序，結(jié)果共獲得9個(gè)麥谷蛋白基因。三品種A位點(diǎn)PCR片段大小均為1 382 bp，其中包括ATG上游197 bp和TAA下游51 bp的序列。序列比對發(fā)現(xiàn)三個(gè)品種之間的擴(kuò)增序列完全相同，且其編碼區(qū)序列與NCBI登錄號(hào)KJ152523.1序列完全一致。濟(jì)南17、濟(jì)麥262和濟(jì)麥229的B位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小分別為1 344、1 341 bp和1 195 bp，ATG上游均為174 bp片段，TAA下游分別為111 bp（濟(jì)麥262和濟(jì)南17）和106 bp片段（濟(jì)麥229）。序列比對發(fā)現(xiàn)濟(jì)南17和濟(jì)麥262的序列相似性較高，為99.5%，僅存在3個(gè)SNP和1個(gè)三堿基的插入／缺失。濟(jì)麥229與其他兩個(gè)品種之間的序列差距較大。濟(jì)南17、濟(jì)麥262和濟(jì)麥229的D位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小均為1 594 bp，包括ATG上游605 bp片段和TAA下游71 bp片段。三個(gè)序列中僅濟(jì)南17存在1個(gè)SNP位點(diǎn)的差異。

圖1 供試材料LMW-GS和α、γ-醇溶蛋白PCR結(jié)果

利用DNAMAN軟件將擴(kuò)增得到的麥谷蛋白基因核酸序列翻譯成蛋白序列，發(fā)現(xiàn)A位點(diǎn)的蛋白序列在三個(gè)品種間無差異，其翻譯的氨基酸數(shù)目為376，N端第一個(gè)氨基酸均為異亮氨酸（I）。D位點(diǎn)蛋白序列在三個(gè)品種間也無差異，其翻譯的氨基酸數(shù)目為304，N端第一個(gè)氨基酸均為甲硫氨酸（M）。在B位點(diǎn)濟(jì)南17和濟(jì)麥262翻譯的氨基酸個(gè)數(shù)分別為351和350，濟(jì)麥229翻譯后的氨基酸數(shù)目為303（圖2），三條序列N端第一個(gè)氨基酸均為M。從圖2可以發(fā)現(xiàn)三條氨基酸序列均含有8個(gè)半胱氨酸（C），其中7個(gè)半胱氨酸的位置相同，濟(jì)南17和濟(jì)麥262第一個(gè)半胱氨酸位于重復(fù)區(qū)；而濟(jì)麥229的第一個(gè)半胱氨酸位于N端區(qū)，剩余7個(gè)半胱氨酸均位于C端區(qū)。

2.2 醇溶蛋白基因的克隆與序列分析

三個(gè)品種中共獲得6條α-醇溶蛋白基因和8條 γ-醇溶蛋白基因，gli-α的片段大小為841～896 bp，gli-γ的片段大小為976～1 098 bp。通過序列分析發(fā)現(xiàn)所克隆的醇溶蛋白基因中包括8個(gè)假基因（gli-α3條，gli-γ5條）和6個(gè)含有完整編碼區(qū)的醇溶蛋白基因（gli-α3條、gliγ3條）。對6條醇溶蛋白基因（圖1B）進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，3條gli-α序列相似性為96%，3條gli-γ序列的相似性為94%。

利用DNAMAN軟件將擴(kuò)增得到的醇溶蛋白基因序列翻譯成蛋白序列發(fā)現(xiàn)，濟(jì)南17、濟(jì)麥262和濟(jì)麥229的gli-α氨基酸個(gè)數(shù)分別為287、297和297，其中濟(jì)南17的α-醇溶蛋白在多聚谷氨酰胺區(qū)Ⅰ的位置少了10個(gè)Q。gli-γ的氨基酸個(gè)數(shù)分別為295、327和327。分析CD誘發(fā)因子發(fā)現(xiàn)，克隆得到的gli-α蛋白均含有T-細(xì)胞毒性抗原表位（圖3），其中濟(jì)南17含有DQ2.5-gli-α3，位于N-端重復(fù)區(qū)。濟(jì)麥262和濟(jì)麥229含有DQ2.5-gli-α1和DQ2.5-gli-α3，位于N-端重復(fù)區(qū)。另外，克隆獲得的三個(gè)品種的gli-α 中 均 未 發(fā) 現(xiàn)LGQGSFRPSQQN和LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽。gli-γ蛋白序列分析未發(fā)現(xiàn)DQ2.5-gli-γ1，但發(fā)現(xiàn)了DQ8.5-gli-γ1（PQQSFPQQQ）的存在，位于重復(fù)Ⅱ區(qū)。

圖2 B位點(diǎn)LMW-GS蛋白序列比對

圖3 gli-α蛋白序列比對

2.3 B位點(diǎn)低分子量麥谷蛋白的進(jìn)化分析

基于三個(gè)品種B位點(diǎn)低分子量麥谷蛋白序列差異較大，在NCBI中搜索小麥B位點(diǎn)的完整低分子量麥谷蛋白序列（共18個(gè)）與本試驗(yàn)推導(dǎo)的三個(gè)B位點(diǎn)蛋白序列進(jìn)行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有序列中的半胱氨酸（C）的位置相對比較保守，其中第2、3、4、5、6和8位的C位置一致，但第1和7位置的C位置不固定，第1個(gè)C位于N端區(qū)的共 有2個(gè) （登 錄 號(hào) 為AAQ63839.1和AAP87371.1）。

圖4

系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有低分子量麥谷蛋白序列共分為5組（圖4）。其中，濟(jì)麥229的B位點(diǎn)低分子量麥谷蛋白獨(dú)自成第Ⅲ組。Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ組序列的第1個(gè)C的位置位于重復(fù)區(qū)，其中Ⅰ、Ⅴ組C的位置后于Ⅱ組20個(gè)氨基酸；Ⅲ和Ⅳ組的第一個(gè)C的位置位于N端區(qū)。對于第7個(gè)C的位置，Ⅳ和Ⅴ組的位置前于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組16個(gè)氨基酸。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)成熟低分子量麥谷蛋白N端序列的第一個(gè)氨基酸，可以將LMW-GS分為m-type、stype和i-type，分別對應(yīng)的氨基酸為甲硫氨酸（M）、絲氨酸（S）和異亮氨酸（i）［15，16］。Ikeda等［17，18］從Norin 61中分離出12類LMW-GS基因，其中2類i-type、2類s-type和8類mtype，利用中國春缺四體將這些基因分別定位到A位點(diǎn)（3類）、B位點(diǎn)（2類）和D位點(diǎn)（7類）。Huang等［19］從Glenlea中獲得12個(gè)具有完整開放閱讀框的LMW-GS基因，其中1個(gè)編碼itype、2個(gè)編碼s-type、9個(gè)編碼m-type蛋白。通過對供試材料LMW-GS基因的克隆及蛋白翻譯發(fā)現(xiàn)，供試三個(gè)品種A位點(diǎn)蛋白均為i-type型蛋白、B位點(diǎn)為m-type型蛋白、D位點(diǎn)為mtype型蛋白。該結(jié)果豐富了三個(gè)品種的谷蛋白信息。

研究表明α-、γ-醇溶蛋白中存在的T-細(xì)胞毒性抗原表位是誘發(fā)CD的重要原因。在普通六倍體小麥A、B、D基因組中，B基因組含有較少數(shù)量的毒性多肽，D基因組中含有的毒性多肽相對較多，李文旭等［20］對鄭麥366的9個(gè)α-醇溶蛋白進(jìn)行CD分析發(fā)現(xiàn)，ZM366-1和ZM366-2中存在LGQGSFRPSQQN毒性態(tài)，并發(fā)現(xiàn)4種T-細(xì)胞毒性抗原表位在9個(gè)α-醇溶蛋白中差異分布。Li等［21］在Zhengmai 004中共發(fā)現(xiàn)39個(gè)T-細(xì)胞毒性抗原表位。本研究克隆的α-醇溶蛋白分別含有1～2個(gè)T-細(xì)胞毒性抗原表位，位于N-端重復(fù)區(qū)，在獲得的α-醇溶蛋白序列中未發(fā)現(xiàn)LGQGSFRPSQQN和LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽。由于本研究只是克隆了三個(gè)品種的部分α-醇溶蛋白，所以該結(jié)果并不能表明這三個(gè)品種不含有以上兩個(gè)毒性態(tài)。γ-醇溶蛋白基因序列含有1個(gè)T-細(xì)胞毒性抗原表位，位于重復(fù)Ⅱ區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)γ-醇溶蛋白Ⅱ重復(fù)區(qū)和Ⅲ非重復(fù)區(qū)附近乳糜瀉毒性相對較強(qiáng)，該結(jié)果表明在普通小麥品種中也有足夠?qū)е氯槊訛a發(fā)生的潛力，與前人研究結(jié)果基本一致［22］。

低分子量麥谷蛋白亞基通常都含有8個(gè)半胱氨酸（C）殘基，第1和第7個(gè)能形成分子間二硫鍵。兩個(gè)C殘基在位點(diǎn)上存在顯著變異，可能是導(dǎo)致LMW-GS結(jié)構(gòu)和功能差異的主要因素；其余6個(gè)半胱氨酸殘基所形成的分子內(nèi)二硫鍵對LMW-GS的結(jié)構(gòu)變異也有不同的作用，其中第2和第5個(gè)半胱氨酸殘基的結(jié)合對分子折疊是至關(guān)重要的［23，24］。本研究將獲得的B位點(diǎn)LMW-GS蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)第1和7位C的位置存在較大變異，其中濟(jì)麥229的B位點(diǎn)LMW-GS、AAQ63839.1和AAP87371.1第一個(gè)C位于N端區(qū)，不同于其他序列，且濟(jì)麥229 B位點(diǎn)蛋白序列中1和7位的C位置組合不同于其他序列并獨(dú)自分為一組，表明該序列在進(jìn)化上不同于其他序列，其是否會(huì)影響小麥籽粒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能需要進(jìn)一步研究。