韓冉，毛鳳鑫，程敦公，李豪圣，劉建軍，曹新有，宋健民，辛明明，郭軍，劉成，劉愛峰

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟(jì)南 250100；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，北京 100193）

小麥籽粒淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，淀粉的合成主要由可溶性淀粉合成酶和顆粒結(jié)合淀粉合成酶負(fù)責(zé)。其中顆粒結(jié)合淀粉合成酶與直鏈淀粉的合成密切相關(guān)，該酶又稱Wx蛋白。六倍體普通小麥含有Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1三種Wx蛋白亞基，分別由位于染色體7AS、4AL和7DS上的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1基因編碼。同時含有3個Wx蛋白亞基基因的小麥為普通小麥；缺失1或2個Wx蛋白亞基基因的突變體稱為部分糯小麥［1，2］；同時缺失3個Wx蛋白亞基基因的突變體稱為糯性小麥［3，4］。糯小麥具有獨(dú)特的高支鏈淀粉和麥谷蛋白，加工特性獨(dú)特，營養(yǎng)品質(zhì)好，是一種新食品開發(fā)的優(yōu)質(zhì)原糧。

糯小麥?zhǔn)且环N新小麥類型，籽粒貯存淀粉中支鏈淀粉含量≥99%。目前，對于糯小麥的研究主要集中于加工品質(zhì)、淀粉結(jié)構(gòu)特征、貯藏淀粉合成機(jī)制等方面［5-8］。雖然六倍體小麥中的3個Wx基因已被克?。?］，但這些基因尚不能完全解釋小麥淀粉糯性變異的機(jī)制［10，11］。本研究利用TMT（tandem mass tags）定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，結(jié)合小麥最新基因組（iwgsc＿refseqv1.0 2018）注釋信息［12］和UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫［13］，快速高通量地鑒定2個糯性不同小麥種子中蛋白差異表達(dá)情況，并通過生物信息學(xué)分析方法，對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能和通路等富集分析，以期挖掘影響籽粒糯性的潛在新基因，為小麥品質(zhì)改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全糯性小麥品種濟(jì)糯116（JN116）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所培育，其Wx蛋白的Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1亞基均為缺失突變型，支鏈淀粉含量接近100%。以非糯性小麥品種濟(jì)麥22（JM22）為對照。供試材料種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)南試驗基地，收獲后選取飽滿一致的籽粒保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 種子蛋白提取 稱取適量籽粒樣品至預(yù)冷的研缽中，研磨至粉末，加入4倍體積酚抽提緩沖液（1%蛋白酶抑制劑和2 mmol／L EDTA，10 mmol／L二硫蘇糖醇），超聲裂解。加入等量的Tris平衡酚，5 500×g、4℃離心10 min，加入5倍的0.1 mol／L乙酸銨／甲醇沉淀12 h，分別用甲醇和丙酮進(jìn)行洗滌。用8 mol／L尿素溶解后利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2 胰酶酶解 在蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇，濃度調(diào)至5 mmol／L，在56℃下放置30 min。加入碘代乙酰胺使其濃度為11 mmol／L，室溫黑暗環(huán)境培養(yǎng)15 min。然后將樣品的尿素濃度稀釋至2 mol／L以下。按照1∶50的質(zhì)量比例（胰蛋白酶∶蛋白）加入胰蛋白酶，37℃消化過夜。然后以1∶100的質(zhì)量比例（胰酶∶蛋白）加入胰蛋白酶并繼續(xù)酶解4 h。

1.2.3 高效液相色譜（HPLC）分級及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 肽段用高pH反向HPLC分級，然后注入到NSI離子源中進(jìn)行電離，再進(jìn)入Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜進(jìn)行分析。該試驗由杭州景杰生物科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 差異蛋白篩選 將各個樣本的相對定量值取log2（以使得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布），然后用雙樣本雙尾t檢驗方法計算兩個樣本中蛋白的差異表達(dá)顯著性（P值）。當(dāng)P＜0.05時，以差異表達(dá)倍數(shù)變化超過1.5作為顯著上調(diào)的變化閾值，小于0.67作為顯著下調(diào)的變化閾值。

1.3.2 差異蛋白的注釋及功能分析 利用Uni-Prot-GOA數(shù)據(jù)庫 （http://www.ebi.ac.uk/GOA/）進(jìn)行GO蛋白質(zhì)組注釋。Wolfpsort（https://wolfpsort.hgc.jp/）用于預(yù)測差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位。根據(jù)KEGG網(wǎng)站（http://www.genome.jp/kegg/）分類注釋KEGG通路。采取聚類分析法研究差異蛋白在KEGG通路、蛋白結(jié)構(gòu)域和GO等特定功能上的差異以及關(guān)聯(lián)性［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥籽粒蛋白鑒定

測序結(jié)果顯示：濟(jì)糯116共獲得5 423個蛋白，濟(jì)麥22共獲得5 417個，根據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平差異倍數(shù)為1.5以上且P＜0.05的條件對濟(jì)糯116和濟(jì)麥22籽粒質(zhì)譜鑒定獲得的蛋白進(jìn)行篩選，共獲得161個差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白59個、下調(diào)蛋白102個（圖1）。

圖1 濟(jì)糯116和濟(jì)麥22差異表達(dá)蛋白定量火山圖

2.2 差異蛋白的亞細(xì)胞定位

對差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要集中在葉綠體中，其次為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外。細(xì)胞外下調(diào)蛋白數(shù)目（25）遠(yuǎn)大于上調(diào)蛋白數(shù)目（4）；在葉綠體、細(xì)胞核、液泡和線粒體中，下調(diào)蛋白的數(shù)目也大于上調(diào)蛋白的數(shù)目（表1）。

表1 差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分布

2.3 差異表達(dá)蛋白的GO和KEGG分析

對2個小麥品種中鑒定出的161個差異蛋白進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果（表2）表明，在生物學(xué)過程中，差異蛋白基因主要富集在代謝過程（metabolic process，56）、細(xì)胞過程（cellular process，44）及單一細(xì)胞生物進(jìn)程（single-organism process，43）；單一細(xì)胞生物進(jìn)程、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）、對刺激的反應(yīng)（response to stimulus）及定位（localization）中下調(diào)蛋白數(shù)目多于上調(diào)蛋白。在細(xì)胞組成中，差異蛋白基因主要富集在細(xì)胞（cell，29）、細(xì)胞器（organelle，20）中。在分子功能中，差異蛋白基因主要富集在催化活性（catalytic activity，56）和結(jié)合（binding，48）中。在細(xì)胞組成和分子功能中，胞外區(qū)（extracellular region）、分子功能調(diào)節(jié)（molecular function regulator）及營養(yǎng)儲存庫活性（nutrient reservoir activity）中下調(diào)蛋白的數(shù)目遠(yuǎn)大于上調(diào)蛋白，其中營養(yǎng)儲存庫活性的差異蛋白為醇溶蛋白、谷蛋白、燕麥蛋白等種子貯存蛋白（表3）。

表2 差異表達(dá)蛋白在GO二級分類中統(tǒng)計分布

在分子功能中，GO富集分析（圖2）發(fā)現(xiàn)淀粉合成酶活性類［glycogen（starch）synthase activity］的蛋白差異倍數(shù)最大，其次為核糖體RNA N-糖基化酶活性類（rRNA N-glycosylase activity）和RNA糖基化酶活性類（RNA glycosylase activity）蛋白；酶調(diào)控活性類（enzymeregulatoractivity）和分子功能調(diào)控類（molecular function regulator）的蛋白數(shù)目較多，其次為酶抑制活性（enzyme inhibitor activity）、營養(yǎng)儲存庫活性（nutrient reservoir activity）等。

KEGG是連接已知分子間相互作用的信息網(wǎng)絡(luò)，如代謝通路、復(fù)合物、生化反應(yīng)等。通過KEGG富集，161個差異蛋白中有36個差異蛋白富集到13個代謝途徑中。顯著富集的有4條代謝途徑（表4），包括核糖體（ribosome）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、氮代謝（nitrogen metabolism）和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（alanine，aspartate and glutamate metabolism）。其中核糖體代謝途徑中包含10個差異表達(dá)蛋白，這些蛋白均上調(diào)表達(dá)；淀粉和蔗糖代謝途徑中有8個差異表達(dá)蛋白，其中6個上調(diào)，2個下調(diào)；氮代謝途徑中包含3個下調(diào)蛋白；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝中包含4個下調(diào)蛋白。

表3 營養(yǎng)儲存庫活性類相關(guān)差異表達(dá)蛋白

圖2 差異表達(dá)蛋白在GO功能分類中的分子功能富集分布?xì)馀輬D

2.4 蛋白結(jié)構(gòu)域富集分析

對于差異表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行富集分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，上調(diào)蛋白質(zhì)與淀粉合酶、催化結(jié)構(gòu)域（starch synthase，catalytic domain）、核糖體蛋白L7Ae／L30e／S12e／Gadd45（ribosomal protein L7Ae／L30e／S12e／Gadd45）、50S核糖體蛋白L30e-樣（50S ribosomal protein L30e-like）、糖基轉(zhuǎn)移酶家族1（glycosyltransferase，family 1）有關(guān)。下調(diào)的差異蛋白與雙功能抑制劑／植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白／種子存儲螺旋結(jié)構(gòu)域（bifunctional inhibitor／plant lipid transfer protein／seed storage helical domain）及雙功能胰蛋白酶／α-淀粉酶抑制劑螺旋結(jié)構(gòu)域（bi-functional trypsin／alpha-amylase inhibitor helical domain）等有關(guān)。

圖3 濟(jì)糯116與濟(jì)麥22差異表達(dá)蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域富集分析

2.5 與淀粉合成相關(guān)的差異蛋白

通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)淀粉和蔗糖代謝通路（starch and sucrose metabolism）中所涉及到的差異基因有8個，2個為下調(diào)蛋白（圖4綠色部分），其登錄號為A0A1D6BU17和Q9FUU6；6個為上調(diào)蛋白（紅色部分），分別為A0A1D6BW01、A0A341XU21、Q2WGB1、A0A341V6U2、A0A341VM83、A0A1D5U5L3，其中A0A1D6BW01、A0A341XU21和Q2WGB1為淀粉合成酶（starch synthase）；A0A341V6U2、A0A341VM83為α-1，4葡聚糖磷酸化酶L同工酶（alpha-1，4 glucanphosphorylase L isozyme）；A0A1D5U5L3為1，4-α-葡聚糖分支酶（1，4-alpha-glucan-branching enzyme）（表4）。

3 討論與結(jié)論

種子發(fā)育和成熟的過程也是貯藏物質(zhì)逐漸累積的過程［15］。種子內(nèi)的貯藏物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)、脂肪、糖類及其他含氮物。本研究利用TMT技術(shù)對糯性小麥濟(jì)糯116和非糯性小麥濟(jì)麥22的成熟籽粒進(jìn)行蛋白組分析，共獲得161個差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白59個，下調(diào)蛋白102個。對差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，位于葉綠體的差異蛋白數(shù)目最多。對差異蛋白進(jìn)行功能分析表明，參與淀粉合成的蛋白差異倍數(shù)最大，這與兩個供試品種在淀粉組成上存在較大差異有關(guān)。另外，核糖體代謝途徑及淀粉和蔗糖代謝途徑中的差異蛋白最多，表明除淀粉和蔗糖代謝外，核糖體代謝也可能參與小麥糯性機(jī)制。

貯藏蛋白多存在于胚乳，包括麥谷蛋白、醇溶蛋白、燕麥蛋白、球蛋白等。貯藏蛋白與營養(yǎng)品質(zhì)及食品加工品質(zhì)密切相關(guān)［16］。差異蛋白分析發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)儲存庫活性類相關(guān)差異表達(dá)蛋白包含多種貯藏蛋白（表3），其中P10387（高分子量麥谷蛋白亞基DY10）和A0A1D5S346（γ-醇溶蛋白）的表達(dá)量上調(diào)，表明濟(jì)糯116籽粒中γ-醇溶蛋白和DY10的蛋白含量高于濟(jì)麥22。但α-醇溶蛋白（A0A0K2QJX7、J7HT09、A0A0E3Z6M6、I0IT52和A0A0E3Z7G8）、燕麥蛋白（A0A1D6DC72和A0A341XLT1）等蛋白的含量低于濟(jì)麥22。

圖4 淀粉合成通路中的差異蛋白

貯藏蛋白的生物合成依賴于氨基酸的合成和氮代謝［17］。谷氨酰胺與谷氨酸是氨基酸生物合成的基礎(chǔ)物質(zhì)，而谷氨酰胺合成酶（GS）在銨基轉(zhuǎn)換為谷氨酰胺和谷氨酸的過程中發(fā)揮重要作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)差異蛋白中參與氨基酸代謝和氮代謝的蛋白均下調(diào)表達(dá)，且谷氨酰胺合成酶（Q6RUJ0）的表達(dá)量也下調(diào)。這表明在種子成熟后，濟(jì)糯116的貯藏蛋白合成量低于濟(jì)麥22。

在造粉體內(nèi)，淀粉的合成是由ADPG焦磷酸化酶（EC 2.7.7.27）、淀粉合成酶（EC 2.4.1.21）、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（EC 2.4.1.242）、淀粉分支酶（EC 2.4.1.18）和淀粉去分支酶（EC 2.4.1.41）等多種酶協(xié)同作用，通過復(fù)雜的途徑完成的［19］。其中淀粉分支酶是引入α-1，6分支鍵的唯一酶，在支鏈淀粉合成中起著重要作用，并與其他淀粉合成酶一起完成對淀粉多聚體的精細(xì)修剪［20］。顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（EC 2.4.1.242）與淀粉粒特異性結(jié)合，使合成的直鏈淀粉保持未分支狀態(tài)。本研究對糯性小麥濟(jì)糯116和非糯性小麥濟(jì)麥22蛋白組學(xué)比較發(fā)現(xiàn)淀粉分支酶（EC 2.4.1.18）的量上調(diào)，上調(diào)比率為1.810（A0A1D5U5L3）；而顆粒結(jié)合型淀粉合成酶的量下調(diào)，下調(diào)比率分別為0.229（A0A1D6BU17）和0.308（Q9FUU6）。濟(jì)糯116的Wx蛋白的Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1亞基均缺失，這是導(dǎo)致顆粒結(jié)合型淀粉合成酶的量下調(diào)及支鏈淀粉含量上升的主要原因。除此以外，淀粉分支酶量的增加也是導(dǎo)致支鏈淀粉含量增加的一個原因。