宋國琦，李瑋，張淑娟，張榮志，李玉蓮，高潔，李吉虎，陳明麗，李根英

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟(jì)南 250100）

小麥（Triticum aestivurn L.）是世界上最主要的糧食作物之一，在糧食安全中占有舉足輕重的地位。低溫是影響作物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子之一。近來，許多研究闡述了植物miRNAs在冷脅迫響應(yīng)中的作用。擬南芥中發(fā)現(xiàn)16個miRNAs參與冷脅迫響應(yīng)［1-3］。在楊樹中鑒定出19個冷脅迫響應(yīng)miRNAs［4］，其中6個與擬南芥中相同。Zhang等［5］在短柄草中發(fā)現(xiàn)了25個冷脅迫響應(yīng)的特異性miRNAs。這些研究表明冷響應(yīng)miRNAs既具有保守性又具有調(diào)控特異性。在普通小麥中，許多保守的、小麥屬特異的及小麥中特異的miRNAs被鑒定出來，包括小麥A基因組的祖先、B基因組的祖先及AABBDD異源六倍體小麥［6-11］。小麥中許多miRNAs在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著 重 要 的 作 用［8，12，13］。 在 冷 脅 迫 響 應(yīng) 中，miR167c、tae-miR167d、tae-miR172a、tae-miR393、tae-miR396a和tae-miR444c.1這6個miRNAs在小麥溫敏核不育系（TGMS）中響應(yīng)冷脅迫［14］；miR159、miR164、miR169、miR319、miR398、miR1029和miR1126這7個miRNAs在小麥苗期響應(yīng)冷脅迫［8］。分析小麥中應(yīng)答不同脅迫反應(yīng)的miRNAs發(fā)現(xiàn)，對于多樣性的生物脅迫和非生物脅迫，miRNAs表現(xiàn)出交叉應(yīng)答反應(yīng)，這表明小麥已經(jīng)發(fā)展了復(fù)雜的miRNA介導(dǎo)途徑應(yīng)對不斷變化的環(huán)境［15］。因此，研究小麥幼穗中miRNAs的冷脅迫響應(yīng)機(jī)制，有助于在miRNAs層面上理解小麥生殖階段的冷響應(yīng)機(jī)制，為提高小麥春季抗凍性提供理論依據(jù)。

本課題組對處于藥隔期的濟(jì)麥22幼穗低溫脅迫后進(jìn)行了miRNA分析和降解組分析。共發(fā)現(xiàn)來自105個家族的192個保守miRNAs和9個新miRNAs，其中34個保守miRNAs和5個新miRNAs在冷脅迫前后表達(dá)差異顯著。對這些miRNAs的靶基因預(yù)測和降解組驗證表明，差異表達(dá)miRNAs的靶基因多數(shù)具有應(yīng)答刺激、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和離子運(yùn)輸?shù)墓δ?。其中?3個miRNAs的靶基因參與花發(fā)育過程，如ARF（auxin response factor），SPB（squamosa promoter binding like protein）和AP2（AP2-like ethylene-responsive transcription factor）等，其中miR160和miR167的靶基因均為ARF。前期結(jié)果顯示，tae-miR167d在藥隔期的幼穗中低溫誘導(dǎo)后下調(diào)表達(dá)，而其靶基因ARF12則上調(diào)表達(dá)［15］。這一結(jié)果與Tang等［14］在小麥冷誘導(dǎo)溫敏不育系過程中的發(fā)現(xiàn)一致，他們推測tae-miR167d和靶基因ARF在小麥溫敏核不育系的穗發(fā)育中可能控制冷誘導(dǎo)的雄性不育。另有研究表明，miR167家族參與調(diào)控植物花和果實的發(fā)育［16-19］，而其靶基因ARF則是一類響應(yīng)生長素信號的轉(zhuǎn)錄因子，通過特異性的結(jié)合生長素初期響應(yīng)基因啟動子區(qū)域AuxRE元件（TGTCNC）調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達(dá)，從而引發(fā)生長素介導(dǎo)的許多生理效應(yīng)［20-22］。

我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)tae-miR167d和靶基因ARF12在小麥生殖發(fā)育階段響應(yīng)冷脅迫［15］，但其在小麥中的時空表達(dá)情況仍不清楚。本研究通過分析tae-miR167d及其靶基因ARF12在小麥不同發(fā)育時期的表達(dá)模式和組織表達(dá)特異性，以及冷脅迫下不同小麥品種tae-miR167d和ARF12的表達(dá)水平，探討了tae-miR167d及其靶基因ARF12在小麥中的時空表達(dá)模式及冷脅迫后二者的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為濟(jì)麥22、臨麥4號、京411、豫麥47、魯原502、周麥22、西農(nóng)889和濮麥053。將小麥種子浸水至萌發(fā)后，置于4℃冰箱春化30 d，將芽苗修剪后移栽至直徑20 cm的花盆中，花盆基質(zhì)為草炭土，每盆種植6株。濟(jì)麥22和西農(nóng)889每個材料種植21盆，其余6個材料每個種植9盆。在人工氣候室的可控環(huán)境下生長，設(shè)置晝／夜溫度為22℃／16℃，光／暗周期為16 h／8 h，光照強(qiáng)度300μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%～70%。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法 濟(jì)麥22和西農(nóng)889每個時期取生長發(fā)育一致的材料9株，每3株為一個重復(fù)，共3個重復(fù)。分別取三葉期、二棱期（7葉）的葉片，取雌雄蕊分化期（拔節(jié)）、四分體期（挑旗）和開花期的葉片、葉鞘、莖和幼穗，用錫箔紙包好，放入液氮中速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

小麥品種濟(jì)麥22、西農(nóng)889、魯原502、臨麥4號、周麥22、豫麥47、濮麥053和京411每6株為1個重復(fù)，共3個重復(fù)。在雌雄蕊分化期進(jìn)行0℃處理48 h，分別取正常生長和0℃處理48 h的葉片和幼穗，用錫箔紙包好，放入液氮中速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小麥RNA提取及cDNA合成 分別取0.1 g樣品于液氮研磨后，利用miRcute多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒（天根，北京）進(jìn)行總RNA的提取，利用Nanodrop 2000／2000C分光光度計（Thermo，美國）進(jìn)行RNA濃度的測定。利用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（Clontech，美國）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄用于tae-miR167d的qRT-PCR分析；利用PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄用于ARF12的qRT-PCR分析。

1.2.3 熒光定量PCR tae-miR167d定量PCR引物為tae-miR167d-F和miRNA-specific Primer，內(nèi)參為U6 Forward Primer和U6 Reverse Primer。tae-miR167d-F引物序列如下：CTGAAGCTGCCAGCATGATCTA，miRNA-specific Primer、U6 Forward Primer和U6 Reverse Primer為Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（Clontech，美國）提供。qRTPCR按 照Light Cycler 480 SYBR GreenⅠ（Roche，德國）說明書進(jìn)行反應(yīng)體系配制和反應(yīng)程序設(shè)定，在Light Cycler 480實時定量PCR儀（Roche，德國）上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃5 s，60℃20 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。

ARF12定量PCR引物為ARF12-F／R，以小麥Actin為內(nèi)參，引物序列如下：ARF12-F／R，ATAGATCAGGCTGGCAGCTTGT／GCACATCCTCTGGTGAAAGTATCT；TaActin-F／R，GCCACACTGTTCCAATCTATGA／TGATGGAATTGTATGTCGCTTC（AB181991）。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 s，56℃20 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。

反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線。每個反應(yīng)3個技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法分析試驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 tae-miR167d和ARF12在小麥相同發(fā)育時期不同器官中的表達(dá)分析

分析濟(jì)麥22和西農(nóng)889中相同發(fā)育時期葉片、葉鞘、莖和穗中tae-miR167d及靶基因ARF12的表達(dá)情況（圖1），發(fā)現(xiàn)在雌雄蕊發(fā)育時期以葉片為參照，濟(jì)麥22葉鞘和莖中tae-miR167d表達(dá)上升，幼穗中tae-miR167d表達(dá)下降，而葉鞘中ARF12表達(dá)下調(diào)，莖和幼穗中ARF12表達(dá)上調(diào)；西農(nóng)889葉鞘、莖和幼穗中tae-miR167d表達(dá)均下降，ARF12表達(dá)均上升。在挑旗期和開花期以葉片為參照，濟(jì)麥22和西農(nóng)889葉鞘、莖和幼穗中tae-miR167d表達(dá)下調(diào)，靶基因ARF12的表達(dá)上調(diào)，二者呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。比較濟(jì)麥22和西農(nóng)889中tae-miR167d和ARF12表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，在雌雄蕊發(fā)育時期，濟(jì)麥22的葉鞘和莖中tae-miR167d的表達(dá)高于ARF12，而西農(nóng)889中正好與濟(jì)麥22相反。

圖1 tae-miR167d及靶基因ARF12在濟(jì)麥22（A）和西農(nóng)889（B）相同時期不同器官中的表達(dá)分析

2.2 tae-miR167d和ARF12在小麥不同發(fā)育時期相同器官中的表達(dá)分析

分析濟(jì)麥22和西農(nóng)889不同發(fā)育時期葉片、葉鞘、莖和穗中tae-miR167d及靶基因ARF12的表達(dá)情況（圖2），發(fā)現(xiàn)隨著生育進(jìn)程推進(jìn)，與三葉期葉片相比，濟(jì)麥22葉片中tae-miR167d表達(dá)下調(diào)，靶基因ARF12表達(dá)上調(diào)；在西農(nóng)889葉片中，除開花期tae-miR167d表達(dá)上調(diào)，其他3個時期均下調(diào)，而靶基因ARF12表達(dá)上調(diào)。與雌雄蕊發(fā)育時期的葉鞘相比，濟(jì)麥22挑旗期和開花期葉鞘中的tae-miR167d的表達(dá)下調(diào)，靶基因ARF12的表達(dá)上調(diào)；在西農(nóng)889中，挑旗期葉鞘中的taemiR167d的表達(dá)下調(diào)，靶基因ARF12的表達(dá)上調(diào)，而開花期葉鞘中tae-miR167d和ARF12均下調(diào)。與雌雄蕊發(fā)育時期相比，濟(jì)麥22在挑旗期和開花期的莖和幼穗中tae-miR167d的表達(dá)均下降，靶基因ARF12的表達(dá)均上升；西農(nóng)889挑旗期莖中tae-miR167d的表達(dá)上調(diào)，靶基因ARF12的表達(dá)下調(diào)，在開花期莖中tae-miR167d和靶基因ARF12的表達(dá)均下降；西農(nóng)889幼穗中挑旗和開花期tae-miR167d和靶基因ARF12的表達(dá)也呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。比較濟(jì)麥22和西農(nóng)889相同時期不同器官中tae-miR167d和靶基因ARF12表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在葉鞘中兩個品種差異明顯。

圖2 tae-miR167d及靶基因ARF12在濟(jì)麥22（A）和西農(nóng)889（B）不同時期相同器官中的表達(dá)分析

2.3 冷脅迫前后不同小麥品種tae-miR167d及ARF12的表達(dá)分析

每個小麥品種冷脅迫后分別與自己的對照相比較，分析耐倒春寒不同8個小麥品種中taemiR167d及靶基因ARF12冷脅迫后的表達(dá)模式，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，在葉片中，濟(jì)麥22、京411、豫麥47、魯原502和西農(nóng)889冷脅迫后tae-miR167d表達(dá)下調(diào)而ARF12上調(diào)，臨麥4號tae-miR167d上調(diào)而ARF12下調(diào)，在上述6個品種中，taemiR167d和ARF12二者呈負(fù)調(diào)控關(guān)系；周麥22和濮麥053中tae-miR167d和ARF12同時上調(diào)表達(dá)。在幼穗中，濟(jì)麥22、京411、豫麥47、魯原502、周麥22和西農(nóng)889冷脅后tae-miR167d表達(dá)下調(diào)而ARF12上調(diào)，濮麥053中tae-miR167d上調(diào)而ARF12下調(diào)，在這7個品種中tae-miR167d和ARF12二者呈負(fù)調(diào)控關(guān)系；臨麥4號taemiR167d和ARF12存在同時上調(diào)表達(dá)情況。通過分析發(fā)現(xiàn)冷脅迫前后tae-miR167d和ARF12的表達(dá)在多數(shù)品種中存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖3 不同小麥品種冷脅迫后葉片和幼穗中tae-miR167d和ARF12相對表達(dá)量

與濟(jì)麥22正常生長條件下的葉片相比較（圖4A），正常生長條件下，除魯原502中taemiR167d的表達(dá)量比濟(jì)麥22高，其余6個品種tae-miR167d的表達(dá)量均比濟(jì)麥22低；而ARF12的表達(dá)量除在京411、魯原502和周麥22中比濟(jì)麥22低，其余4個品種均比濟(jì)麥22高。冷脅迫后，tae-miR167d的表達(dá)量在臨麥4號、魯原502和濮麥053中比濟(jì)麥22中高，在其余4個品種中比濟(jì)麥22的表達(dá)量低；而ARF12的表達(dá)量除在周麥22和西農(nóng)889中比濟(jì)麥22高，在其余5個品種中均比濟(jì)麥22低。與濟(jì)麥22正常生長條件下的幼穗相比較（圖4B），發(fā)現(xiàn)正常生長條件下，7個品種中tae-miR167d和ARF12的表達(dá)量均比濟(jì)麥22中高。冷脅迫后，tae-miR167d的表達(dá)量除在京411中比濟(jì)麥22中低，在其余6個品種中均比濟(jì)麥22中高；而ARF12的表達(dá)量除在魯原502、周麥22和濮麥053中比濟(jì)麥22中低，在其余4個品種中均比濟(jì)麥22中高。比較葉片和幼穗中tae-miR167d和ARF12的表達(dá)趨勢發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下，在葉片中tae-miR167d的表達(dá)量低于ARF12，而幼穗中tae-miR167d的表達(dá)量高于ARF12。

圖4 相同對照下不同品種小麥葉片（A）和幼穗中（B）tae-miR167d和ARF12的相對表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

本課題組在研究倒春寒脅迫響應(yīng)miRNAs時，發(fā)現(xiàn)小麥幼穗中tae-miR167d參與冷響應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)其靶基因為ARF12。qRT-PCR結(jié)果顯示，小麥幼穗中tae-miR167d在低溫誘導(dǎo)后下調(diào)表達(dá)，而其靶基因ARF12則上調(diào)表達(dá)［15］。本研究的目的是驗證上述結(jié)果，并明確耐倒春寒品種和不耐倒春寒品種中tae-miR167d及其靶基因ARF12的表達(dá)特異性，為小麥耐倒春寒品種的篩選提供依據(jù)。因此，在設(shè)計試驗時，參考已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)選出耐倒春寒強(qiáng)的品種濟(jì)麥22、臨麥4號、京411和豫麥47，和耐倒春寒弱的品種魯原502、周麥22、西農(nóng)889和濮麥053，共8個品種參加試驗［23，24］。首先分析了倒春寒抗性不同品種濟(jì)麥22和西農(nóng)889中不同器官和不同時期taemiR167d和靶基因ARF12的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，在多數(shù)情況下，tae-miR167d和靶基因ARF12呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，這一結(jié)果驗證了前期的研究結(jié)果［15］。另外，在雌雄蕊發(fā)育時期，濟(jì)麥22和西農(nóng)889的葉鞘和莖中tae-miR167d和ARF12表達(dá)存在明顯差異，這是否是導(dǎo)致它們耐倒春寒能力不同的原因還需要進(jìn)一步驗證。同時，該結(jié)果也表明在小麥耐倒春寒過程中，葉鞘和莖發(fā)揮著重要作用。

分析8個小麥品種葉片和幼穗冷脅迫前后tae-miR167d和ARF12表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)受到冷脅迫后，多數(shù)品種中tae-miR167d和ARF12的表達(dá)呈負(fù)調(diào)控關(guān)系，這一結(jié)果與前期的研究結(jié)果一致［15］。分別以濟(jì)麥22的葉片和幼穗為對照，分析不同抗性品種中tae-miR167d和ARF12表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，在葉片中，冷脅迫后除臨麥4號中taemiR167d的表達(dá)水平高于ARF12，其余6個品種中tae-miR167d的表達(dá)水平均低于ARF12的表達(dá)水平，與濟(jì)麥22中表達(dá)模式一致；在幼穗中，冷脅迫后濟(jì)麥22、京411、豫麥47和西農(nóng)889中taemiR167d的表達(dá)水平低于ARF12的表達(dá)水平，其余4個品種中tae-miR167d的表達(dá)水平高于ARF12的表達(dá)水平。這與最初耐倒春寒強(qiáng)的品種和耐倒春寒弱的品種的分類并不完全一致。分析可能的原因：一是上述小麥品種來自不同的生態(tài)區(qū)，對低溫的耐受性不同；二是小麥耐倒春寒是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，單純的從某個角度不能全面揭示耐倒春寒的機(jī)理［15，25-27］。