崔德周，李永波，隋新霞，黃琛，楊在東，樊慶琦，楚秀生，3

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／小麥玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司，山東 濟(jì)南 250100；3.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

鹽脅迫是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的全球性問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約8.3億公頃的耕地遭受著土壤鹽漬化的侵蝕［1］。我國鹽堿地總面積約為3 600萬公頃，鹽脅迫每年造成的糧食減產(chǎn)達(dá)總產(chǎn)的15%以上［2］。小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一，也是鹽漬化土壤重要的栽培作物，其耐鹽性的高低直接決定是否能夠穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)。因此克隆小麥耐鹽基因，解析其對鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制，對小麥耐鹽遺傳改良具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子是生物體內(nèi)一類重要的調(diào)節(jié)蛋白，它們通過與啟動子區(qū)域的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，直接調(diào)控下游靶基因的表達(dá)［3］。AP2／EREBP（APETALA 2／ethylene-responsive element binding protein）類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，因含有AP2／EREBP結(jié)構(gòu)域而得名。在擬南芥中，Sakuma［4］和張麒［5］等根據(jù)其序列相似性和AP2／EREBP結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，將其分為AP2（APETALA 2）、RAV（related to ABI3／VP1）和EREBP（ethylene-responsive element binding protein）三大類型。EREBP型轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其在DNA結(jié)合區(qū)第14位和第19位的氨基酸序列差異，又可分為DREB（dehydration-responsive element binding protein）亞族和ERF（ethylene-responsive factor）亞族，其中DREB亞族第14位和第19位分別是纈氨酸和谷氨酸，而ERF亞族則是丙氨酸和天冬氨酸［4］。隨著基因組學(xué)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，擬南芥、水稻、黃瓜、苜蓿等多種植物中ERF亞族的系統(tǒng)鑒定與分析被陸續(xù)報(bào)道［6-9］。

ERF類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［5，10，11］。擬南芥ERF109通過介導(dǎo)茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長素合成通路間的交互作用，調(diào)控側(cè)根的發(fā)生［12］。過表達(dá)蘋果ERF3基因可促進(jìn)花青苷和原花青苷的積累［13］。大豆ERF3基因可被高鹽、干旱等誘導(dǎo)表達(dá)，將其在煙草中過表達(dá)后，可顯著提高煙草對高鹽和干旱脅迫的耐受能力［14］。普通小麥中ERF類轉(zhuǎn)錄因子成員有47個(gè)［15］，主要參與應(yīng)答生物或非生物逆境脅迫，然而，目前僅有少數(shù)幾個(gè)ERF基因被克隆，并進(jìn)行相應(yīng)的研究。研究表明，小麥ERF1基因的表達(dá)受高鹽、干旱、低溫、ABA、乙烯、水楊酸以及白粉病菌侵入的誘導(dǎo)［16］；Zhu等克隆了受病原菌誘導(dǎo)的TaPIE1（pathogeninduced ERF1）基因，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受紋枯病菌和低溫脅迫共同誘導(dǎo)［17］；TaERF3基因除應(yīng)答高鹽和干旱脅迫外，對病原菌侵入和外源激素處理也有響應(yīng)［18，19］；TaERF4基因在擬南芥中通過抑制液泡膜NHX活性，負(fù)調(diào)控耐鹽性［20］；TaERF8-2B在調(diào)控普通小麥株高、抽穗期和千粒重中發(fā)揮重要作用［21］，而TaERF8-2A和TaERF8-2D基因雖已被克隆，但尚未對其功能進(jìn)行解析，更未有在耐鹽小麥品種中進(jìn)行基因功能分析的報(bào)道。

本研究利用本團(tuán)隊(duì)獲得的耐鹽小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從耐鹽小麥品種德抗961中克隆了鹽脅迫下持續(xù)上調(diào)的基因TaERF8-2D，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位和鹽脅迫下的基因表達(dá)分析，以期為深入研究該基因在小麥鹽脅迫中的耐鹽功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用耐鹽小麥品種為德抗961，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥種質(zhì)創(chuàng)新與利用團(tuán)隊(duì)保存。

1.2 TaERF8-2D基因克隆及生物信息學(xué)分析

利用本團(tuán)隊(duì)獲得的耐鹽小麥品種德抗961的轉(zhuǎn)錄組EST數(shù)據(jù)，通過Ensembl小麥基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)獲得特異引物（F：5′-ATGGTCTCCGCTCTGTCC-3′；R：5′-TCACGAGTCTTTATTATTTTTGTGC-3′），以德抗961幼苗葉片cDNA為模板，擴(kuò)增TaERF8-2D基因的CDS序列。PCR擴(kuò)增程序：95℃5 min；95℃30 s，50℃30 s，72℃45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min；16℃，保存。膠回收后的DNA，連接到pEASY-Blunt Cloning Kit（全式金，北京），并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α（全式金，北京）。挑選陽性克隆，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司（青島）進(jìn)行測序。

利用ExPASy-ProtParam（http://www.expasy.org／tools／protparam.html）和ProtScale（https://web.expasy.org／protscale／）分別分析TaERF8-2D蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性。使用SignalP 5.0在線工具（http://www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進(jìn)行信號肽預(yù)測。采用TMHMM 2.0在線軟件 （http://www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM-2.0／）預(yù)測TaERF8-2D蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。通過NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）在線預(yù)測分析蛋白的磷酸化位點(diǎn)。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa＿automat.pl？page＝npsa＿sopma.html）對編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

1.3 亞細(xì)胞定位分析

設(shè)計(jì)帶有XbaⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的特異性引物 （F：5′-GCTCTAGAATGGTCTCCGCTCTGTCC-3′；R：5′-ACGCGTCGACCGAGTCTTTATTATTTTTGTGC-3′），擴(kuò)增無終止密碼子的TaERF8-2D全長CDS片段，經(jīng)雙酶切后，連接到表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-GFP，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，然后篩選陽性克隆。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，鑒定陽性克隆并保存。將重組質(zhì)粒和對照空載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，室溫培養(yǎng)過夜，在激光共聚焦顯微鏡下，觀察原生質(zhì)體中綠色熒光的分布情況。

1.4 鹽脅迫下的基因表達(dá)分析

將室溫22℃、光照培養(yǎng)10 d的德抗961小麥幼苗置于250 mmol／L NaCl溶液中進(jìn)行脅迫處理，分別在處理0、3、6、12、24 h和48 h時(shí)取第一片展開葉片，液氮速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按照植物組織RNA快速提取試劑盒（天根生化，北京）提取小麥葉片總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（全式金，北京）合成cDNA第一鏈。利用TaERF8-2D基因的特異引物［21］（F：5′-CGACAGATTGCAGCAACAACAACAGTG-3′；R：5′-CCCGTTGTGCCTGAGCTCGATATA-3′）和Tubulin內(nèi)參引物（F：5′-TCGATGA TCTCCAACTCCACCAGT-3′；R：5′-TCGTCGAACTCAGCACCAACTTCT-3′）進(jìn)行RT-PCR。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaERF8-2D基因的克隆

以耐鹽小麥德抗961的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，在750 bp左右出現(xiàn)一個(gè)特異DNA條帶（圖1）。通過對其回收和測序，發(fā)現(xiàn)該片段長度為762 bp，編碼253個(gè)氨基酸。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 TaERF8-2D編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析利用SOPMA網(wǎng)站對該基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲比例最高，占68.39%，α-螺旋占19.76%，延伸鏈占8.30%，β-轉(zhuǎn)角占3.56%（圖2）。

2.2.2 蛋白理化性質(zhì)分析 通過ExPASy-Prot-Param分 析，TaERF8-2D蛋 白 的 分 子 式 為C1176H1845N353O365S6，分子量為26.96 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為9.55，不穩(wěn)定系數(shù)為57.39，推測該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。對該蛋白的親水性、疏水性進(jìn)行分析表明，其總平均吸水性為-0.521，屬于親水蛋白（圖3）。

2.2.3 蛋白信號肽預(yù)測 利用SignalP 5.0和TMHMM 2.0在線預(yù)測表明，該蛋白既無信號肽，也不存在跨膜結(jié)構(gòu)域（圖4），由此推斷該蛋白不是分泌蛋白。

圖2 TaERF8-2D蛋白的二級結(jié)構(gòu)

圖3 TaERF8-2D蛋白的親水性和疏水性預(yù)測

圖4 TaERF8-2D信號肽（A）及跨膜結(jié)構(gòu)域（B）分析

2.2.4 氨基酸磷酸化修飾位點(diǎn)分析 使用在線軟件NetPhos 3.1對TaERF8-2D蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白共有30個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)最多，有16個(gè)；其次為蘇氨酸（Thr），磷酸化位點(diǎn)有13個(gè)；而酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)僅有1個(gè)（圖5）。

圖5 TaERF8-2D蛋白的氨基酸磷酸化位點(diǎn)分析

2.3 亞細(xì)胞定位

將含有重組載體pCAMBIA2300-35S：：TaERF8-2D-GFP和對照空載體pCAMBIA2300-35SGFP的菌液，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入擬南芥原生質(zhì)體，25℃暗培養(yǎng)24 h后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。結(jié)果顯示，TaERF8-2D：：GFP融合蛋白僅在細(xì)胞核有明顯的綠色熒光，而對照空載體在細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都可以觀察到綠色熒光信號，由此表明，編碼的TaERF8-2D蛋白定位于細(xì)胞核（圖6）。這與報(bào)道的ERF類轉(zhuǎn)錄因子主要定位于細(xì)胞核的結(jié)論相一致［22，23］，主要參與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。

圖6 TaERF8-2D蛋白的亞細(xì)胞定位

2.4 鹽脅迫下TaERF8-2D基因的表達(dá)分析

利用RT-PCR檢測TaERF8-2D基因?qū)}脅迫的響應(yīng)特性。結(jié)果顯示，在鹽脅迫24 h和48 h時(shí)，該基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)（圖7），進(jìn)一步證明TaERF8-2D基因可能與小麥鹽脅迫的響應(yīng)密切相關(guān)。

圖7 TaERF8-2D基因響應(yīng)鹽脅迫的RT-PCR分析

3 討論與結(jié)論

ERF類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物發(fā)育、代謝和抗逆過程［5，10-14］，是改良植物遺傳特性的優(yōu)異基因資源。ERF類轉(zhuǎn)錄因子主要參與逆境脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育，在眾多的ERF類轉(zhuǎn)錄因子成員中，僅有少數(shù)幾個(gè)ERF基因從普通小麥中被克隆出來［16，18-21，24］。本研究利用本團(tuán)隊(duì)獲得的耐鹽小麥轉(zhuǎn)錄組及其基因表達(dá)數(shù)據(jù)，從耐鹽小麥品種中篩選到對鹽脅迫響應(yīng)非常明顯的基因TaERF8-2D。而有關(guān)TaERF8-2D基因編碼的蛋白信息以及該基因?qū)π←滬}脅迫的響應(yīng)尚未見報(bào)道，因此明確該基因編碼蛋白質(zhì)的特性、亞細(xì)胞定位以及鹽脅迫下的基因表達(dá)模式，對于進(jìn)一步探究該基因的耐鹽功能具有重要意義。

蛋白質(zhì)的理化特性、亞細(xì)胞定位與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，小麥TaERF8-2D基因編碼的蛋白質(zhì)屬于親水蛋白，沒有信號肽且不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于分泌蛋白，該蛋白定位于細(xì)胞核，這與大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的定位信息相一致［22］。蛋白質(zhì)磷酸化作為一種重要的翻譯后修飾，是調(diào)控蛋白質(zhì)活力和功能的重要機(jī)制，廣泛參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆脅迫等多種生物過程［25］。本研究表明，TaERF8-2D蛋白共有30個(gè)氨基酸磷酸化位點(diǎn)，推測TaERF8-2D基因可能經(jīng)過蛋白磷酸化修飾后，行使其響應(yīng)鹽脅迫等逆境脅迫的生物學(xué)功能。

前人研究表明，ERF類轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)植物鹽脅迫方面扮演重要角色。本研究RT-PCR結(jié)果表明，鹽脅迫處理后，TaERF8-2D表達(dá)被顯著誘導(dǎo)，這與OsERF103、GmERF3、TaERF1、TaERF3等ERF類轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)趨勢相似［14，16，19，26］，暗示TaERF8-2D基因在小麥鹽脅迫響應(yīng)過程中可能發(fā)揮重要作用，但其具體調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。