黃糧 吳瑞霞 王嵐 肖杰 成忠

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430030)

急性心肌梗死(AMI)具有較高的發(fā)病率，且已嚴重威脅人類生命安全，目前臨床主要采用經(jīng)皮冠狀動脈介入及溶栓等方法治療AMI以避免心肌缺血缺氧，但缺血心肌恢復(fù)血液供應(yīng)后又可誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷〔1〕。因此，如何有效阻止缺血再灌注所致心肌損害及減少心肌細胞凋亡成為AMI治療過程中的首要問題。研究表明缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導的心肌損傷、心力衰竭等疾病的重要發(fā)病機制主要為心肌細胞凋亡增加及活性降低〔2〕。探究H/R誘導心肌細胞增殖及凋亡的作用機制對改善患者心臟功能及降低死亡率均具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，并可通過調(diào)控靶基因表達進而參與細胞分化及凋亡的生物學過程〔3〕。微小RNA-15b-5p(miR-15b-5p)在胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達，并可抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡〔4〕。Liu等〔5〕研究表明，通過抑制大鼠中miR-15b-5p表達可預(yù)防大鼠腦缺血/再灌注損傷，但關(guān)于其具體作用機制尚未完全闡明。通過生物信息學軟件預(yù)測出CRKL是miR-15b-5p的靶基因，張志升等〔6〕研究表明沉默CRKL可促進H/R誘導的心肌細胞凋亡并降低心肌細胞生存率，但關(guān)于其如何調(diào)控心肌細胞凋亡及增殖尚未完全清楚。本研究通過敲低miR-15b-5p表達并進行H/R干預(yù)探討抑制miR-15b-5p表達對H/R誘導心肌細胞凋亡及增殖的影響及其對CRKL基因的調(diào)控作用，擬揭示H/R誘導的心肌損傷等發(fā)病機制，為防治AMI等心臟疾病再灌注損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 大鼠H9C2心肌細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1及空質(zhì)粒均購自湖南豐暉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；miR-15b-5p mimic及陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、miR-15b-5p抑制劑(anti-miR-15b-5p)、anti-miR-NC及轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司；CRKL siRNA(si-CRKL)與陰性對照siRNA(si-NC)均購自美國CST公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本TakaRa公司；小鼠抗人CRKL抗體購自美國Cell Signaling公司；細胞凋亡試劑盒購自江蘇碧云天生物研究所；MTT檢測試劑盒購自美國Sigma公司；野生型及突變型CRKL基因3′UTR熒光素酶表達載體均購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海艾躍生物科技有限公司。

1.2細胞轉(zhuǎn)染及分組 大鼠H9C2心肌細胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長密度至60%時更換為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，分別將miR-15b-5p抑制劑(anti-miR-15b-5p)、anti-miR-NC瞬時轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細胞，將H9C2心肌細胞分為Con組(不進行任何處理的心肌細胞)、anti-miR-15b-5p組、anti-miR-NC組。分別將pcDNA-CRKL轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細胞，將H9C2心肌細胞分為pcDNA組、pcDNA-CRKL組。后續(xù)研究中將anti-miR-NC及anti-miR-15b-5p轉(zhuǎn)染至H9C2細胞以此驗證miR-15b-5p是否靶向調(diào)控CRKL表達。分別將si-NC、si-CRKL與anti-15b-5p共轉(zhuǎn)染至H9C2細胞，將H9C2細胞分為anti-15b-5p+si-NC組、anti-15b-5p+si-CRKL組。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)8 h，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，每組細胞均備2份，一份細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組H9C2心肌細胞用于后續(xù)實驗。

1.3構(gòu)建H/R心肌細胞模型 制備缺氧培養(yǎng)基：采用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，其與氮氣及CO2充分飽和，時間超過3 h。制備復(fù)氧培養(yǎng)基：取含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，置于室溫常氧培養(yǎng)箱，時間超過3 h。取出另一份轉(zhuǎn)染24 h后及未經(jīng)任何處理的H9C2心肌細胞，加入缺氧培養(yǎng)基并置于低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)(缺氧模型)，24 h后取出培養(yǎng)瓶，胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，吸取上清，加入復(fù)氧培養(yǎng)基，放入常氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞(復(fù)氧模型)，培養(yǎng)1 h后檢測細胞凋亡〔7〕。

1.4qRT-PCR檢測H9C2心肌細胞中miR-15b-5p及CRKL mRNA表達 利用Trizol試劑提取H9C2心肌細胞RNA，將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照qRT-PCR試劑盒說明書配置體系，置于實時熒光定量PCR儀檢測miR-15b-5p及CRKL mRNA相對表達量，PCR擴增條件為95℃ 5 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)40次。miR-15b-5p以U6為內(nèi)參基因，CRKL以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算miR-15b-5p及CRKL mRNA相對表達量。

1.5Western印跡檢測H9C2心肌細胞中CRKL蛋白表達 分別取各組H9C2心肌細胞置于EP試管中，分別加入蛋白裂解液經(jīng)離心后提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，使用半干法將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封膜2 h，TBST洗膜，加入CRKL抗體過夜(4℃)，加入二抗，室溫孵育2 h，電化學發(fā)光(ECL)顯色，利用X線膠片顯影定影，并采用Imageproplus6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度。

1.6流式細胞術(shù)檢測H9C2心肌細胞凋亡 應(yīng)用膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)細胞凋亡試劑盒檢測細胞凋亡，收集各組對數(shù)生長期H9C2心肌細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板(密度1×108/L)，0.25%胰酶消化細胞，細胞呈圓形時加入DMEM培養(yǎng)基(含有10%FBS)終止消化，置于離心機離心，棄上清，重懸細胞，分別加入10 ml Annexin V 后室溫下孵育，15 min后使用200目濾網(wǎng)過濾細胞，置于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7MTT檢測H9C2心肌細胞增殖活性 用MTT法檢測H9C2心肌細胞增殖活性，以每孔1×105個細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時加入20 μl、5 mg/ml的MTT溶液，室溫孵育4 h，棄培養(yǎng)液后分別在每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后溶解結(jié)晶物，置于酶標儀上檢測各孔在波長為490 nm處光密度(OD)值，OD值大小即細胞增殖能力。

1.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?使用NCBI下載CRKL的3′UTR序列并利用Primer5.0設(shè)計引物，瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，收回純化的擴增片段，構(gòu)建WT-CRKL、MUT-CRKL載體，轉(zhuǎn)染前收集H9C2心肌細胞，以每孔2×104個細胞的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板，將miR-15b-5p mimic與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細胞，含有10% FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，更換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染2 h后收集細胞裂解液，根據(jù)熒光素酶檢測試劑盒說明書操作，利用生物發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件行t檢驗、單因素方差分析及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1H/R處理對心肌細胞中miR-15b-5p和CRKL表達的影響 相比于Con組(0.97±0.08、1.02±0.09、0.57±0.06)，H/R組H9C2心肌細胞中miR-15b-5p表達(2.73±0.18)顯著升高，CRKL mRNA及蛋白表達(0.47±0.08、0.22±0.04)顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 H/R處理對心肌細胞中CRKL 蛋白表達的影響

2.2抑制miR-15b-5p表達對H/R誘導心肌細胞凋亡的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示H/R+anti-miR-15b-5p組H9C2心肌細胞中miR-15b-5p表達(1.14±0.11)顯著低于H/R+anti-miR-NC組(2.77±0.21，P<0.05)，提示抑制miR-15b-5p表達細胞系轉(zhuǎn)染效率較高；Con組(1.00±0.08)顯著低于H/R組(2.81±0.16)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與Con組〔(7.69±0.81)%〕相比，H/R組H9C2心肌細胞凋亡率〔(21.47±2.06)%〕明顯升高(P<0.05)。與H/R+anti-miR-NC組〔(23.46±2.17)%〕相比，H/R+anti-miR-15b-5p組細胞凋亡率〔(14.28±1.39)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 細胞凋亡流式圖

2.3抑制miR-15b-5p表達對H/R處理心肌細胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，H/R組心肌細胞OD值顯著低于Con組(P<0.05)，H/R+anti-miR-15b-5p組顯著高于H/R+anti-miR-NC組(P<0.05)，見圖3。

與Con組比較：1)P<0.05；與H/R+anti-miR-NC組比較：2)P<0.05圖3 各組心肌細胞增殖比較

2.4過表達CRKL對H/R誘導心肌細胞凋亡和增殖的影響 通過構(gòu)建CRKL過表達載體并轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細胞，轉(zhuǎn)染后構(gòu)建H/R模型，Western印跡驗證CRKL過表達轉(zhuǎn)染效率，H/R+pcDNA-CRKL組H9C2心肌細胞中CRKL蛋白表達(0.47±0.03)顯著高于H/R+pcDNA組(0.24±0.02，P<0.05)，H/R組(0.26±0.03)顯著低于Con組(0.61±0.05)，表明CRKL過表達轉(zhuǎn)染成功。流式細胞術(shù)及MTT實驗結(jié)果顯示H/R組H9C2心臟細胞凋亡率〔(24.57±2.35)%〕顯著高于Con組〔(8.13±0.84)%〕，H/R+pcDNA-CRKL組〔(15.47±1.38)%〕相較于H/R+pcDNA組〔(26.79±2.17)%〕明顯降低(P<0.05)，而H9C2心肌細胞增殖活性顯著高于H/R+pcDNA組(P<0.05)。見圖4，圖5。

1～4：Con組、H/R組、H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-CRKL組圖4 CRKL蛋白表達

與Con組比較:1)P<0.05；與H/R+pcDNA組比較:2)P<0.05圖5 過表達CRKL對H/R誘導的心肌細胞增殖的影響

2.5miR-15b-5p靶向調(diào)控CRKL的表達 采用microRNA.Org等靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p與CRKL存在靶向作用，分別轉(zhuǎn)染miR-15b-5p mimic、miR-NC與WT-CRKL、MUT-CRKL的熒光素酶報告基因載體進入心肌細胞，檢測熒光素酶活性變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-15b-5p mimic后，相對于miR-NC組(1.02±0.08)，攜帶有WT-CRKL報告基因載體的心肌細胞熒光素酶活性明顯降低(0.39±0.04，P<0.05)，而攜帶有MUT-CRKL報告基因載體的心肌細胞在轉(zhuǎn)染miR-15b-5p mimic后熒光素酶活性無明顯變化(0.99±0.07、1.01±0.09，P>0.05)。Western印跡進一步驗證miR-15b-5p與CRKL的靶向調(diào)控關(guān)系，結(jié)果顯示miR-15b-5p組H9C2心肌細胞中CRKL蛋白表達(0.24±0.03)明顯低于miR-NC組(0.59±0.05，P<0.05)，anti-miR-15b-5p組(0.87±0.07)明顯高于anti-miR-NC組(0.57±0.06，P<0.05)，見圖6，圖7。

圖6 CRKL 3′UTR中與miR-15b-5p互補的核苷酸序列

1～4：miR-NC組、miR-15b-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-15b-5p組圖7 miR-15b-5p調(diào)控CRKL蛋白的表達

2.6抑制CRKL表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-15b-5p表達對H/R誘導心肌細胞凋亡和增殖的作用 分別共轉(zhuǎn)染si-NC、si-CRKL與anti-15b-5p進入H/R誘導的H9C2心肌細胞，Western印跡結(jié)果顯示H/R+anti-15b-5p+si-CRKL組CRKL蛋白表達(0.42±0.04)明顯低于H/R+anti-15b-5p+si-NC組(0.74±0.06,P<0.05)，H/R+anti-miR-156-5p組(0.72±0.07)明顯高于H/R+anti-miR-NC組(0.21±0.03)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示H/R+anti-miR-15b-5p組H9C2心肌細胞凋亡率〔(12.57±1.14)%〕明顯低于H/R+anti-miR-NC組〔(22.76±2.11)%〕，H/R+anti-15b-5p+si-CRKL組〔(17.69±1.73)%〕相較于H/R+anti-15b-5p+si-NC組〔(10.78±1.34)%〕明顯升高(P<0.05)，而心肌細胞活性明顯降低(P<0.05)，見圖8，圖9。

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-15b-5p組、anti-miR-15b-5p+si-NC組、anti-miR-15b-5p+si-CRKL組圖8 CRKL蛋白表達

與H/R+anti-miR-NC組比較:1)P<0.05；與H/R+anti-15b-5p+si-NC組比較:2)P<0.05圖9 抑制CRKL表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-15b-5p表達對H/R誘導的心肌細增殖的促進作用

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷可引發(fā)心律失常及心肌梗死等狀況，研究顯示缺血再灌注損傷心肌細胞中細胞凋亡蛋白表達水平升高，并可促使心肌細胞凋亡〔8，9〕。因此減少缺血再灌注損傷誘發(fā)的心肌細胞凋亡可有效保護AMI患者心肌。部分miRNA異常表達可能在心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用〔10〕。因此本研究進一步探究miRNA對H/R誘導心肌細胞凋亡和增殖的作用機制，可為心血管疾病治療提供新靶點。

miR-15b-5p具有多種生物學功能并可調(diào)控子宮肌瘤等不同腫瘤細胞增殖及凋亡過程〔11〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-15b可調(diào)節(jié)血管生成、心肌缺血再灌注損傷及細胞凋亡等過程，進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-15b在缺血再灌注損傷小鼠模型的心肌細胞中呈高表達，并可抑制Bcl-2表達進而促使細胞凋亡〔12，13〕。miR-15b-5p異常表達與冠狀動脈疾病發(fā)生及發(fā)展過程密切相關(guān)〔14～16〕。由此推測miR-15b-5p可促進心肌細胞凋亡并抑制細胞增殖。本研究結(jié)果說明H/R處理后心肌細胞中miR-15b-5p呈高表達。本研究通過抑制miR-15b-5p表達并進行H/R處理，結(jié)果說明抑制miR-15b-5p表達可增強H/R誘導的心肌細胞增殖能力并降低心肌細胞凋亡率。提示心肌細胞H/R損傷可能與miR-15b-5p表達水平升高有關(guān)，抑制miR-15b-5p表達可能對心肌細胞H/R損傷具有保護作用。

腫瘤抑制因子SASH1可與CRKL相互作用進而抑制結(jié)直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，研究發(fā)現(xiàn)miR-1827可靶向調(diào)節(jié)CRKL表達進而調(diào)節(jié)肺腺癌腫瘤細胞遷移、侵襲及血管生成過程〔17，18〕。H/R誘導的心肌細胞中CRKL蛋白表達明顯降低，通過采用shRNA敲低CRKL基因表達可能通過降低p-ERK1/2蛋白表達進而促進H/R誘導的心肌細胞凋亡〔19，20〕。本研究結(jié)果說明CRKL蛋白表達水平降低可加重H/R誘導的心肌細胞損傷。通過構(gòu)建CRKL過表達載體轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細胞行H/R處理，結(jié)果說明CRKL過表達可減少H/R引起的心肌細胞損傷并可能改善患者心臟功能。提示上調(diào)CRKL表達水平可能減輕H/R誘發(fā)的組織器官損傷。本研究證實miR-15b-5p高表達可促進心肌細胞凋亡，經(jīng)生物信息學預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p與CRKL可能存在靶向作用，進一步采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-15b-5p可靶向調(diào)控CRKL基因表達，提示miR-15b-5p可能通過下調(diào)CRKL基因表達進而促進心肌細胞凋亡。本研究轉(zhuǎn)染CRKL siRNA沉默CRKL表達，結(jié)果說明抑制CRKL表達可逆轉(zhuǎn)抑制miR-15b-5p表達對H/R誘導的心肌細胞凋亡和增殖的作用。提示miR-15b-5p可直接靶向調(diào)控CRKL表達進而促進H/R誘導的心肌細胞凋亡并降低細胞增殖能力。由此可知，H/R誘導的心肌細胞損傷過程中CRKL蛋白表達降低，miR-15b-5p高表達并可降低CRKL蛋白表達進而促進心肌細胞凋亡。

綜上，miR-15b-5p在H/R損傷過程中發(fā)揮重要作用，抑制miR-15b-5p可減少H/R誘導的心肌細胞凋亡并促進細胞增殖，而miR-15b-5p可能是通過負向調(diào)控CRKL而發(fā)揮作用，miR-15b-5p可能成為臨床診斷及治療AMI的重要靶點基因。但關(guān)于miR-15b-5p與CRKL是如何調(diào)控H/R損傷誘導的心肌細胞凋亡及其可能作用通路均需深入研究。