李文超, 宋永紅, 陳劍鋒

(山東省血液中心, 1. 檢驗科, 2. 血型參比室, 山東 濟南, 250014)

準確鑒定血液樣本的血型是確保臨床用血安全的重要一環(huán)。山東省血液中心于2013年引進奧林巴斯PK7300血型分析儀，對獻血者血液樣本進行血型檢測，相較于手工操作，全自動血型儀可有效規(guī)避人為因素造成的檢測錯誤，如讀取樣本條碼、加樣、試劑分配、混勻震蕩、孵育時間、結果判定等過程可全部實現(xiàn)標準化和自動化，結果準確性高，重復性好。但全自動血型儀實際檢測過程中存在部分樣本使用機器無法自動判讀結果的情況。本研究回顧性分析奧林巴斯PK7300全自動血型分析儀檢測的獻血者血液樣本結果，探討血型儀在血型檢測中的實際應用效果，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料

以2016年1月—2019年12月山東省血液中心采集的266 168名獻血者(其中男169 547名，女96 621名)的血液樣本為研究對象。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 常規(guī)篩查試劑和儀器: 抗-A、抗-B單克隆抗體血型正定型試劑、紅細胞反定型試劑和Rh檢測試劑均購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司，血型儀為奧林巴斯PK7300全自動血型分析儀。

1.2.2 鑒定試劑和儀器: 單克隆抗A抗體、抗B抗體、抗M抗體和抗N抗體均為IgM型抗體，購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司; 抗D抗體(IgM/IgG型)、抗人球蛋白試劑、鑒定不規(guī)則抗體用篩選細胞、譜細胞均購自荷蘭Sanquin公司; 抗人球蛋白微柱凝膠卡購自美國BIO-RAD公司。所有試劑均經(jīng)過批檢合格，且在有效期內使用。儀器有Bio-Rad IH-1000全自動血型儀(美國Bio-Rad公司)、KUBOTA-KA2200血清學離心機(日本久保田公司)、金壇數(shù)顯三用恒溫箱HH-W600(江蘇金壇市科析儀器有限公司)和HITACHI-MC450紅細胞洗滌離心機(日本日立公司)，均在校準有效期內使用。

1.3 方法

1.3.1 血型檢測: 應用PK7300全自動血型儀，以梯形微孔板法檢測，機器自動使用0.9%生理鹽水稀釋樣品血漿(血漿與鹽水比例為1∶2.5), 樣本紅細胞抗原濃度稀釋到1.5%; 手工稀釋試劑紅細胞懸液濃度為1.7%, 稀釋正定標準血清(1∶40), 樣本和試劑加入梯形微孔板中混合后孵育1 h，血型儀用高精確度CCD相機拍照，根據(jù)設定參數(shù)判斷結果。梯型微板為孔壁呈階梯狀的特殊V型微孔板，階梯級寬16 μm, 為2～3個紅細胞直徑之和(正常紅細胞直徑6～8 μm), 級高100 μm。經(jīng)過孵育、紅細胞自然沉降，發(fā)生相應的抗原抗體反應時，紅細胞彼此聚集成凝塊，掛在階梯上均勻分布于孔底; 未發(fā)生抗原抗體反應時，紅細胞沿階梯滾落于孔底中央，形成實心圓點，再運用數(shù)碼成像和電腦數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)判斷血型。檢測結果未出現(xiàn)凝集呈實心圓點判定為陰性，凝集平鋪無圓點判定為陽性，判定規(guī)則見圖1。使用PK7300血型儀對獻血者樣本進行ABO正反定型和RhD血型檢測，對篩查出來的ABO正反定型不符、O細胞凝集、凝塊、溶血以及異常稀釋樣本(指混入保養(yǎng)液或獻血者采血前大量喝水)使用紙片法和試管法手工復核，仍不能確定結果的進行血型鑒定; 重度乳糜樣本根據(jù)目視微孔板結果進行判定，不再進行手工復核。

1.3.2 不規(guī)則抗體鑒定方法: 采用鹽水法、經(jīng)典抗人球蛋白法以及抗人球蛋白微柱凝膠卡法對送檢樣本進行鑒定。① 鹽水介質抗體鑒定方法，在試管中分別加入100 μL血漿和50 μL篩選細胞或譜細胞，室溫放置15～30 min, 3 400 轉/min離心15 s觀察結果，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象則判斷為陽性。② 經(jīng)典抗人球蛋白方法，在試管中分別加入100 μL血漿和 50 μL篩選細胞或譜細胞, 37 ℃孵育30 min, 用生理鹽水三洗后(3 400 轉/min離心1 min)加抗人球蛋白試劑50 μL, 3 400轉/min離心15 s觀察結果，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象則判斷為陽性。③ 抗人球蛋白微柱凝膠卡法，按試劑說明書操作。

2 結 果

2.1 血型儀一次性判讀結果

2016—2019年共檢測無償獻血者血液樣本402 649份(排除重復獻血次數(shù)，獻血者共計266 168名)。全自動血型分析儀一次性判讀成功399 841份(99.30%), 判讀失敗2 808份(0.70%), 失敗原因包括ABO正反定型不符、O細胞凝集、血凝塊、溶血以及樣本稀釋等。手工復核后仍有125份(4.45%)樣本的結果難以判定，送血型參比室鑒定，其中ABO正反定型不符樣本101份、O細胞凝集反應樣本24份。見表1、2、3。RhD初篩陰性樣本2 730份，送血型參比室確認。

表1 402 649份血液樣本的血型儀判讀結果 份

表2 血型儀判讀失敗樣本復核結果 份

表3 ABO正反定型不符和O細胞凝集樣本送檢結果 份

2.2 異常血型鑒定結果

經(jīng)鑒定, 101份ABO血型正反定型不符樣本中，血型正常44份，亞型26份，含MNSs-抗-M抗體31份; 24份O細胞凝集反應樣本中，血型正常7份，含MNSs-抗-M抗體14份，冷自身抗體2份，溫自身抗體1份。合計血型正常51份，血型異常74份(包括A亞型5份, B亞型8份, AB亞型13份，溫自身抗體1份，冷自身抗體2份, MNSs-抗-M抗體45份)。男性血型異常率為0.27‰(46/169 547), 女性血型異常率為0.29‰(28/96 621), 差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 見表4。2 730份RhD初篩陰性樣本中, RhD陰性2 644份(96.85%), RhD陽性86份(3.15%), 見表5。

表4 57份ABO正反定型不符和17份O細胞凝集樣本鑒定結果 份

表5 初篩RhD陰性樣本鑒定結果 份

2.3 不規(guī)則抗體血液制品處置情況

74份ABO血型檢測異常的血液制品根據(jù)具體檢測情況采取不同處置策略，其中全血報廢36份，部分制品報廢(洗滌紅細胞正常使用，懸浮紅細胞和血漿報廢)34份，正常發(fā)往臨床4份。見表6。

表6 74份亞型或不規(guī)則抗體血液制品處置情況[n(%)]

3 討 論

PK7300全自動血型分析儀可代替手工血型檢測方法對血液樣本進行檢測，得到了血站工作人員的一致好評[1-3]。山東省血液中心于2013年購置全自動血型分析儀，并將其用于ABO、Rh血型以及鹽水介質中的抗體檢測，證實其具有自動化程度高、結果判讀準確、檢測速度快、適用于大批量檢測等特點。PK7300全自動血型分析儀對鹽水介質反應的意外抗體檢測敏感性較高，能篩出ABO亞型樣本、RhD陰性樣本及一定數(shù)量的不規(guī)則抗體樣本，尤其是抗M類抗體，這類抗體經(jīng)常在血型反定型中被檢出，是造成ABO正反定型不符的主要原因[4]，此外還可檢出極少量的冷自身抗體和溫自身抗體，但未檢出其他血型系統(tǒng)的不規(guī)則抗體。

本研究回顧分析了濟南地區(qū)266 168名無償獻血者402 649份血液樣本的血漿與O型紅細胞鹽水介質反應情況，經(jīng)鑒定74份血液中存在不規(guī)則抗體，不規(guī)則抗體陽性率為0.28‰(74/266 168), 與海南地區(qū)[5]相近，高于深圳地區(qū)的0.021%[6], 但低于南陽地區(qū)的0.050%[7]、常州地區(qū)的0.052%[8]和蘇州地區(qū)的0.084%[9]。造成該差異的原因可能是檢測設備、試劑、方法的不同或者地域差異。

用于不規(guī)則抗體檢測的方法通常有鹽水介質反應法、抗人球蛋白法、微柱凝膠法和凝聚胺法，不同方法的靈敏度不同，檢測到抗體的種類和數(shù)量也不同，故尋找一種能夠使用機器進行血液不規(guī)則抗體篩選的試驗方法一直是各采血供血機構的關注熱點。PK7300全自動血型儀檢測血漿與試劑O細胞的直接凝集反應，僅能檢出鹽水介質反應的抗體，主要是IgM類抗體，難以檢出IgG類抗體。本研究篩查出的74份樣本供應者中有23名為重復獻血者，而在此前獻血篩查過程中并未檢測出含不規(guī)則抗體，其中1名獻血17次才發(fā)現(xiàn)，這說明PK7300血型儀篩查不規(guī)則抗體具有一定偶然性。

獻血者血液中存在不規(guī)則抗體會增加輸血風險，美國、英國、澳大利亞等國家和地區(qū)已將不規(guī)則抗體篩查列為獻血常規(guī)檢測項目[10]。中國部分地區(qū)的醫(yī)院和血站也開展了不規(guī)則抗體篩查的研究工作，如重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院用微柱凝膠抗人球蛋白卡對患者進行輸血前篩查，不規(guī)則抗體陽性率為0.37%(313/85 645)[11]; 北京市海淀區(qū)婦幼保健院篩查孕產婦的不規(guī)則抗體陽性率為0.42%(10/2 356)[12]; 湖北省婦幼保健院篩查孕產婦的不規(guī)則抗體陽性率為0.36%(191/52 524)[13]; 廣州對獻血者進行不規(guī)則抗體篩查，陽性率為0.48%(97/20 160)[14]; 上海市血液中心采用鹽水介質與微量板木瓜酶法相結合的方法對獻血者血液樣本進行檢測，檢出率為1.51‰(1 246/824 072), 是常規(guī)鹽水介質法(0.31‰)的近5倍[10]。這些不規(guī)則抗體檢測法的檢出率高于PK7300血型儀常規(guī)篩查法，進一步提升了臨床用血的安全性。

本中心對ABO亞型及不規(guī)則抗體陽性的獻血者制訂了相應的血液處置策略，在保證用血安全的前提下，盡量減少血液報廢。比A3、B3強的亞型(含A3、B3), 若無不規(guī)則抗A1或不規(guī)則抗B，血液按正常血型處置; 若有不規(guī)則抗A1或不規(guī)則抗B, 與其他不規(guī)則抗體血液處置方式一致，即血漿報廢、紅細胞洗滌后發(fā)放; 比A3、B3弱的亞型(含A3、B3), 則報廢所有血液制品。本研究中，74份亞型或含有不規(guī)則抗體的血液制品，全部報廢者占48.65%, 部分制品報廢者占45.95%, 全部血液制品用于臨床者占5.41%。此外，對篩查出不規(guī)則抗體陽性人群也應精準告知，這對其將來準確輸血和提升輸血效果有著重要意義[15]。

綜上所述, PK7300全自動血型儀能提高工作效率和檢測質量，但確認結果時需進行人工核對，對異常樣本使用試管法復核，不確定結果的樣本送血型參比室鑒定后發(fā)放，避免血型錯誤和含不規(guī)則抗體的血液流入臨床。建議購置PK7300全自動血型儀的血站開展不規(guī)則抗體檢測，以更敏感的方法篩查不規(guī)則抗體，從而降低臨床輸血風險。