楊依真 朱亞非* 王俊輝

急性毛細(xì)支氣管炎（CB）是一種常見(jiàn)于<2歲嬰幼兒的急性下呼吸道感染性疾病，最常見(jiàn)的病原體是呼吸道合胞病毒（RSV）［1］。約70%的兒童在生后第1年感染RSV，至2歲>90%兒童均感染過(guò)RSV。美國(guó)感染RSV的嬰幼兒病死率為0.0022%~0.0024%［2］，西班牙0.11%~0.18%［3］，在中低收入國(guó)家中則更高。早期評(píng)估患兒是否存在發(fā)生重癥RSV感染性毛細(xì)支氣管炎的高危因素十分重要。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組能特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的Zn2+依賴性蛋白水解酶家族，包括MMP1-20。MMPs與RSV感染性毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生、發(fā)展及疾病的嚴(yán)重程度、疾病后期的氣道高反應(yīng)等均有密切關(guān)系［4-7］。本文探討MMP-3基因上rs522616和rs679620位點(diǎn)的基因多態(tài)性與RSV感染性毛細(xì)支氣管炎易感性和嚴(yán)重性的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1月至2018年12月本院診斷毛細(xì)支氣管炎（參考《實(shí)用兒科學(xué)》第8版［8］）的2~24個(gè)月杭州漢族兒童145例（病例組），經(jīng)鼻拭子呼吸道合胞病毒抗原檢測(cè)（膠體金法）診斷為RSV感染，根據(jù)Bearman和Pierson 修訂的臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分［9］分為輕、中度組（122例）和重度組（23例），由專人記錄患兒的病史資料，除去雙胎兒、早產(chǎn)兒、先心病、支氣管肺發(fā)育不良等基礎(chǔ)性疾病患兒。同時(shí)配對(duì)杭州漢族健康兒童124例為對(duì)照組，且均無(wú)毛細(xì)支氣管炎病史。另根據(jù)是否為特異性體質(zhì)（既往有反復(fù)喘息史，或有嚴(yán)重濕疹史，或有藥物、食物過(guò)敏史，或過(guò)敏原檢測(cè)陽(yáng)性），將所有研究對(duì)象分為特異性組（54例）和非特異性組（215例）。病例組和對(duì)照組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在檢查前家屬均簽署知情同意書(shū)，由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 （1）標(biāo)本采集：采集患兒外周血1 ml，離心

后取血清在-80 ℃冰箱冷凍保存，后統(tǒng)一送至杭州祥音生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行基因位點(diǎn)測(cè)序分析。（2）引物設(shè)計(jì)：rs522616引物序列：F-GGGAGGAGGGGAAAAGGTTG，R-GGAGGAAAACCTCATGGGCA。rs679620引物序列：F-AGGCAATGAGTAACAAGTGGA，R-CCTGTA-GGAGAAAAATTGAAGCAGA。（3）基因測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：從標(biāo)本中提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物電泳及純化。將純化后的產(chǎn)物，使用ABI.3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。最后使用Softgenetics公司的Mutation Surveyor軟件進(jìn)行峰圖比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)。評(píng)價(jià)樣本的遺傳平衡狀態(tài)及代表性用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs522616和rs769620基因型分布平衡檢驗(yàn) 見(jiàn)表1。

表1 rs522616和rs769620基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（n）

2.2 病例組和對(duì)照組rs679620的基因型及等位基因分布 病例組和對(duì)照組rs679620位點(diǎn)的基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 rs679620基因型及等位基因分布與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性 重度組AG基因型頻率明顯高于輕、中度組（P<0.05）。見(jiàn)表3。rs679620的基因型及等位基因分布與特異性體質(zhì)無(wú)相關(guān)（P>0.05）。

表3 rs679620輕、中組和重組的基因型及等位基因分布［n（%）］

2.4 rs522616的多態(tài)性可能與特異性體質(zhì)的相關(guān)性 基因型AA在特異性組出現(xiàn)頻率高于非特異性組（χ2=8.679，P<0.05）。見(jiàn)表4。rs522616的多態(tài)性與疾病易感性無(wú)相關(guān)（χ2=0.914、0.262，P>0.05）；且與病情嚴(yán)重程度也無(wú)相關(guān)（χ2=0.895、0.542，P>0.05）。

表4 rs522616在特異性組和非特異性組的基因型及等位基因分布［n（%）］

3 討論

RSV感染呈自限性，但重癥RSV性毛細(xì)支氣管炎可至呼吸衰竭而死亡［10］。導(dǎo)致RSV感染疾病嚴(yán)重度不同的原因尚不明確［11］。感染后宿主的遺傳背景可能是重要因素之一。

MMPs是一組Zn2+依賴性蛋白水解酶家族，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）有非常廣泛的降解功能和調(diào)節(jié)其動(dòng)態(tài)平衡的能力［12］。MMP-3被認(rèn)為是MMPs 家族中的一個(gè)關(guān)鍵酶，位于人基因染色體11q22. 3區(qū)域，能降解多種細(xì)胞分子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。MMP-3基因的多態(tài)性，目前主要有啟動(dòng)子區(qū)域-1171（5A/6A）位點(diǎn)、5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)rs522616位點(diǎn)、2號(hào)外顯子rs679620位點(diǎn)等位點(diǎn)的相關(guān)研究?；虻亩鄳B(tài)性是導(dǎo)致疾病在不同人群中的易感性及嚴(yán)重性存在差異的重要原因［13］。

SATASHI等［14］研究發(fā)現(xiàn)RSV感染會(huì)促進(jìn)MMP-3的表達(dá)。NERUSU等［15］研究認(rèn)為MMP-3有促進(jìn)肺損傷的作用，推測(cè)MMP-3可能是通過(guò)直接損傷血管壁或組織間隙中連接組織的成分促進(jìn)炎癥細(xì)胞的滲出，加重炎癥反應(yīng)，從而加重肺損傷。ANNEMIEKE等［16］研究顯示，在中、重組RSV毛細(xì)支氣管炎患兒中MMP-3及TIMP-1的水平明顯升高，而MMP-3在重度組患兒體內(nèi)升高更為明顯。通過(guò)研究MMP-3的基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在MMP-3基因啟動(dòng)子區(qū)域的rs522616位點(diǎn)的A等位基因可能與RSV感染的嚴(yán)重程度有關(guān)。推測(cè)該等位基因可促使MMP-3的表達(dá)水平過(guò)度升高，從而加重肺組織損傷，這可能是造成重癥RSV感染的重要原因之一。

本研究顯示，rs679620的A等位基因在病例組出現(xiàn)頻率高于對(duì)照組，病例組的等位基因A分布也高于對(duì)照組。AG基因型在重度組出現(xiàn)的頻率高于輕、中度組，提示MMP-3基因上rs679620位點(diǎn)的等位基因A可能與RSV感染性毛細(xì)支氣管炎的易感性有關(guān)，基因型AG可能與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。但rs679620的基因型及等位基因在特異性組和非特異性組分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外MMP-3 SNPrs522616基因型、等位基因頻率與RSV感染性毛細(xì)支氣管炎的易感性均無(wú)明顯相關(guān)，且在輕、中度組與重度組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但rs522616的AA基因型在特異性體質(zhì)組出現(xiàn)頻率明顯高于非特異性體質(zhì)組，提示rs522616的AA基因型可能與人群中的特異性體質(zhì)有關(guān)。本研究結(jié)果與ANNEMIEKE等報(bào)道不一致，可能與人種差異、抽樣誤差、樣本數(shù)小、生長(zhǎng)環(huán)境等有關(guān)。因此，對(duì)于MMP-3基因多態(tài)性與RSV感染性毛細(xì)支氣管炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，還需從不同角度進(jìn)行深入的研究。

本研究結(jié)果顯示，rs522616的AA基因型在特異性體質(zhì)組出現(xiàn)頻率明顯高于非特異性體質(zhì)組，提示MMP-3基因rs522616位點(diǎn)的AA基因型可能與特異性體質(zhì)有關(guān)。特異性體質(zhì)也是易誘發(fā)哮喘的因素之一，有學(xué)者認(rèn)為RSV感染后引起毛細(xì)支氣管炎可能是特異性體質(zhì)的早期標(biāo)志［17］。也有研究認(rèn)為RSV感染后是否出現(xiàn)喘息與特異性體質(zhì)無(wú)明顯關(guān)系［18］。目前傾向RSV感染與特異性體質(zhì)及其他一些先天因素可相互作用，共同促進(jìn)哮喘的發(fā)生。一方面若患兒本身存在特異性體質(zhì)、肺解剖及生理異常等先天因素，在RSV感染后則更易出現(xiàn)喘息及發(fā)展為哮喘；另一方面RSV感染后破壞氣道黏膜上皮，可降低機(jī)體對(duì)變應(yīng)原的防御力，還能誘導(dǎo)機(jī)體免疫狀態(tài)發(fā)生改變。