胡文豪 叢玲華

腎癌是腎實(shí)質(zhì)內(nèi)腎小管上皮系統(tǒng)病變導(dǎo)致，具有發(fā)病率高、晚期預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命健康安全［1］。其發(fā)病率僅次于膀胱癌，居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第二位［2-3］。隨著分子生物學(xué)、靶向醫(yī)學(xué)、基因組織學(xué)不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)人體miRNA存在抑癌基因，具有較高的調(diào)控癌基因作用，在機(jī)體腎癌組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異常，能對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、侵襲能力有效調(diào)節(jié)和管控，進(jìn)而提升患者預(yù)后生存質(zhì)量［4］。miR-34a作為miRNA家族中最重要的成員之一，與腎實(shí)質(zhì)腫瘤組織細(xì)胞增殖、侵襲關(guān)系密切，全程參與腎癌細(xì)胞發(fā)育、增殖、侵襲及凋亡過程，具有較高的研究價(jià)值［5］。本研究探討miR-34a對(duì)腎癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，以期為腎癌的臨床治療和預(yù)后評(píng)估提供靶向理論依據(jù)。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料采集 選擇2019年4月至2020年3月本院手術(shù)切除獲得的腎癌組織標(biāo)本、腎癌旁組織標(biāo)本30例，均由病理科醫(yī)師通過嚴(yán)格的病理實(shí)驗(yàn)鑒定、確診。患者于術(shù)前均未行全身治療，手術(shù)切除組織樣本后立即置入液氮環(huán)境下凍存。本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情并簽署同意書。

1.2 儀器和設(shè)備 Real-time PCR儀（型號(hào)：7300），購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；超低溫冰箱（型號(hào)：MDF-382E），購自日本SANYO；光學(xué)顯微鏡，購自重慶光學(xué)儀器廠；電子天平，凱豐電子天平儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)：DK-S26），購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；全自動(dòng)生化分析儀，購自美國麥克公司；PCR儀（型號(hào)：PC-808），購自日本ASTEC公司；AB SCIEX QTRAP 6500液-質(zhì)聯(lián)用儀，購自美國AB SCIEX公司；高速離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16C），購自湖南星科科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染：①細(xì)胞培養(yǎng)：經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清）開展人腎癌細(xì)胞、癌旁組織細(xì)胞培養(yǎng)，在37℃的二氧化碳（濃度5%）培

養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每間隔2 d對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行更換，若細(xì)胞匯合>80%開展傳代培養(yǎng)。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染：于轉(zhuǎn)染前1 d，將腎癌細(xì)胞準(zhǔn)確接種在6孔板內(nèi)，選擇無抗生素的無菌培養(yǎng)基實(shí)施細(xì)胞培養(yǎng)；在細(xì)胞密度顯示為70%~80%情況下，依據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒的說明書實(shí)施細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染6 h后將6孔板中培養(yǎng)基取出，并加入RPMI 1640培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清。再于37℃的二氧化碳（濃度5%）培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)。（2）miR-34a表達(dá)檢測及分組：提取腎癌細(xì)胞總RNA，經(jīng)熒光定量PCR法檢測腎癌組織細(xì)胞miR-34a表達(dá)，嚴(yán)格按說明書實(shí)施操作。根據(jù)miR-34a表達(dá)（中位數(shù)：1.02×106）分為miR-34a高表達(dá)組（>1.02×106）、miR-34a低表達(dá)組（<1.02×106）［6］。（3）MTT法檢測腎癌細(xì)胞增殖能力：采用MTT法（四唑鹽比色法）對(duì)腎癌細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，轉(zhuǎn)染后經(jīng)0.25%胰酶開展消化離心處理，將5×103個(gè)細(xì)胞準(zhǔn)確接種在96孔板內(nèi)，設(shè)定每孔為200 ml，于37℃的二氧化碳（濃度5%）培養(yǎng)箱內(nèi)行3~4 h培養(yǎng)，后于每孔內(nèi)加入DMSO（150 ml），充分振蕩5~10 min，使晶體充分溶解，并經(jīng)酶標(biāo)儀對(duì)490 nm波長處每孔吸光度值進(jìn)行測定、記錄［7］。（4）Transwell法測定腎癌細(xì)胞侵襲能力：選擇Matrigel基質(zhì)膠，通過培養(yǎng)基（內(nèi)無胎牛血清）根據(jù)9∶1比例稀釋，于37℃條件下過夜凝固。同時(shí)在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后經(jīng)胰蛋白酶消化，將細(xì)胞密度調(diào)整成4×105/ml，并將200 ml準(zhǔn)確加入小室上室，再將培養(yǎng)液（內(nèi)含20%胎牛血清）600 ml加入下室，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，將小室準(zhǔn)確取出，利用甲醛固定，發(fā)現(xiàn)結(jié)晶呈紫染色，于顯微鏡下觀察、拍照，對(duì)穿膜細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)［8］。（5）預(yù)后生存質(zhì)量隨訪：對(duì)患者進(jìn)行12個(gè)月隨訪，對(duì)患者預(yù)后生存時(shí)間進(jìn)行分析，評(píng)估腎癌組織細(xì)胞miR-34a表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用n（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，選擇Kaplan-Meier生存模型分析患者預(yù)后，繪制生存曲線圖，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎癌組織與癌旁組織細(xì)胞內(nèi)miR-34a相對(duì)表達(dá)比較 見表1。

表1 腎癌組織與癌旁組織細(xì)胞內(nèi)miR-34a相對(duì)表達(dá)比較（±s）

表1 腎癌組織與癌旁組織細(xì)胞內(nèi)miR-34a相對(duì)表達(dá)比較（±s）

組別 n miR-34a相對(duì)表達(dá)癌旁組織細(xì)胞 30 1.78±0.22腎癌組織細(xì)胞 30 0.84±0.13 t值 20.148 P值 <0.01

2.2 不同時(shí)間段腎癌組織細(xì)胞吸光度值比較 見表2。

表2 不同時(shí)間段腎癌組織細(xì)胞吸光度值比較（±s）

表2 不同時(shí)間段腎癌組織細(xì)胞吸光度值比較（±s）

組別 n 12 h 24 h 48 h miR-34a低表達(dá)組 30 4.25±0.37 24.69±7.06 42.81±10.09 miR-34a高表達(dá)組 30 4.21±0.26 16.65±4.12 30.16±9.04 t值 4.746 8.061 3.213 P值 <0.01 <0.01 <0.01

2.3 miR-34a對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響 見表3。

表3 miR-34a對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響（±s）

表3 miR-34a對(duì)腎癌細(xì)胞侵襲能力的影響（±s）

組別 n 腎癌侵襲細(xì)胞數(shù)miR-34a低表達(dá)組 30 142.89±11.44 miR-34a高表達(dá)組 30 87.14±9.23 t值 20.774 P值 <0.01

2.4 腎癌組織細(xì)胞miR-34a表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性 miR-34a高表達(dá)組患者的無復(fù)發(fā)生存率明顯高于miR-34a低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 不同miR-34a表達(dá)腎癌患者預(yù)后生存曲線圖

3 討論

隨著生活方式改變，腎癌患病率逐年增高，對(duì)患者生命健康存在嚴(yán)重危害［9］。miR-34a作為高度保守miRNA，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布，存在組織特異性，于肺以外組織內(nèi)廣泛分布。研究顯示，miR-34a存在抑癌作用，能抑制肝癌、乳腺癌等相關(guān)腫瘤，故認(rèn)為miR-34a能明顯影響腎癌［10］。本研究結(jié)果顯示，相比癌旁組織，腎癌組織細(xì)胞內(nèi)miR-34a表達(dá)明顯下降。經(jīng)MTT法、Transwell法對(duì)miR-34a、靶基因干擾腎癌組織細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)行分析，結(jié)果表明miR-34a可明顯抑制腎癌組織細(xì)胞的增殖、侵襲能力，并加速腎癌腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)程［11］。miR-34a通過對(duì)腎實(shí)質(zhì)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲平衡作用進(jìn)行調(diào)節(jié)和管控，加速腫瘤細(xì)胞因子的凋亡周期，進(jìn)而維持人體中腫瘤細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定［12］；一旦機(jī)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)增殖、凋亡平衡紊亂，侵襲能力不受控制，即可誘發(fā)惡性腫瘤疾病，因此臨床治療腎癌過程中，需要對(duì)癌細(xì)胞增殖、侵襲能力進(jìn)行有效抑制，誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞加速凋亡，進(jìn)而縮小腫瘤組織病癥體積，改善患者預(yù)后質(zhì)量［13-14］。

目前，臨床主要通過大劑量化療藥物抑制腎腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力，通過強(qiáng)毒性化學(xué)藥物輸注人體殺滅腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤治療作用［15］。持續(xù)性全身化療療法雖然具有一定的臨床治療效果，能夠有效殺滅腫瘤細(xì)胞因子，抑制癌細(xì)胞的快速增殖和侵襲，延長患者生存時(shí)間。但大多數(shù)化療藥物均具有較高的毒副作用，長期持續(xù)性輸注化療藥物會(huì)給患者帶來嚴(yán)重不良反應(yīng)，降低患者預(yù)后生存質(zhì)量［16］。近年來，隨著生物靶向醫(yī)學(xué)研究的不斷發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)miR-34a經(jīng)對(duì)凋亡通路有關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，經(jīng)Transwell法明確miR-34a高表達(dá)可對(duì)腎癌組織細(xì)胞侵襲能力存在抑制作用，進(jìn)而加速腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)度；提示miR-34a表達(dá)過度可增加細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白-PARP降解產(chǎn)物表達(dá)，miR-34a可將細(xì)胞凋亡通路激活，削弱腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，加快腎癌組織細(xì)胞凋亡［17］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路較多，miR-34a激活的具體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有待深入研究。Notch1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由CSLD-NA結(jié)合蛋白、Notch受體及Notch配體構(gòu)成，參與細(xì)胞增殖、分化活動(dòng)，能對(duì)細(xì)胞分化及增殖、凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞生理及病理過程。大量研究表明，Notch信號(hào)存在促腫瘤作用，腫瘤細(xì)胞組織內(nèi)Notch表達(dá)明顯高于正常組織，與腫瘤增殖、凋亡關(guān)聯(lián)密切［18-19］。本研究結(jié)果顯示，miR-34a高表達(dá)組患者無復(fù)發(fā)生存率明顯高于miR-34a低表達(dá)組；提示miR-34a高表達(dá)能夠提高腎癌患者的無復(fù)發(fā)生存率，改善預(yù)后生存質(zhì)量。miR-34a 通過靶向機(jī)體內(nèi)的多種mRNA，控制腎癌腫瘤細(xì)胞的周期、抑制細(xì)胞增殖、侵襲能力，進(jìn)而有利促進(jìn)人體DNA的修復(fù)進(jìn)程。與此同時(shí)，miR-34a還能夠調(diào)控腎癌干細(xì)胞的惡性表達(dá)，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停止在S期，進(jìn)一步影響腎實(shí)質(zhì)腫瘤的惡性生物學(xué)行為，最終提高患者的無復(fù)發(fā)生存率。

綜上所述，miR-34a通過靶向調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖、侵襲能力，對(duì)機(jī)體腎癌腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)而阻斷細(xì)胞增殖、分化進(jìn)程；miR-34a高表達(dá)能夠提高患者預(yù)后生存質(zhì)量，可作為腎癌臨床預(yù)后評(píng)估的靶向腫瘤標(biāo)志物。