李彥 潘烽平 彭勃 李海強 張明明 周莉

隨著現(xiàn)代外科全直腸系膜切除術（TME）理論的廣泛認可和應用以及術前新輔助放、化療的開展，直腸癌患者在保證腫瘤根治前提下的極限保肛手術屢見不鮮，但仍有5%~40%的患者術后發(fā)生局部復發(fā)或轉(zhuǎn)移［1］。究其原因，考慮與手術殘留但又未被常規(guī)病理學發(fā)現(xiàn)的危險轉(zhuǎn)移灶有關。研究表明，腫瘤在細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化之前，其分子水平及生化代謝水平方面已發(fā)生異常改變，出現(xiàn)功能異常的癌基因產(chǎn)物或產(chǎn)物表達增強，并由此引出腫瘤微轉(zhuǎn)移與腫瘤分子切緣的概念，并可將腫瘤微轉(zhuǎn)移作為評估腫瘤分子切緣的標準之一。本文回顧性分析80例直腸癌患者的臨床資料，通過SATB1介導Snail/Slug信號通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化評估腫瘤微轉(zhuǎn)移，分析直腸癌標本切緣及區(qū)域淋巴結(jié)腫瘤微轉(zhuǎn)移與患者預后相關性，探討SATB1介導上調(diào)Snail/Slug信號通路促進直腸癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤預后的指導價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年5月至2016年5月本院80例直腸癌患者的臨床資料，納入標準：（1）中低位直腸癌Dixon術式，除外Mile’s及Hartmann術式，腫瘤均位于腹膜反折處或腹膜反折以下；（2）均為M0，除外有遠處轉(zhuǎn)移；（3）直腸癌初次治療，除外曾行腫瘤局切或曾行術前新輔助放化療；（4）單純直腸癌，除外罹患其它惡性腫瘤患者。排除標準：（1）術后需進一步行放療；（2）術中下切緣快速冰凍病例切片提示陽性而需補切除；（3）術后石蠟病理回報下切緣或環(huán)周切緣陽性患者。其中男41例，女39例，平均年齡（63.1±9.3）歲。所有患者手術均由同一組醫(yī)生完成，手術方式均為DIXON術式，所有標本采集均獲得本人同意并簽署知情同意書，報醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 方法 （1）標本取材及資料收集：下切緣組織、正常腸黏膜組織、腫瘤組織標本取材時間均為手術中標本離體后立即進行；環(huán)周切緣標本及區(qū)域淋巴結(jié)標本取材與病理科環(huán)周切緣取材同步進行。標本取材后立即放入-80 ℃深低溫冰箱保存?；颊吲R床資料包括：一般資料（性別、年齡、BMI值等）、T分期、N分期、TNM分期、腫瘤分化程度、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、腫瘤直徑（cm）、KRAS及NRAS基因突變情況、微衛(wèi)星DNA穩(wěn)定性、術后化療完成情況及術后隨訪情況（時間依賴生存狀態(tài)，包括無瘤生存時間、局部復發(fā)時間、遠處轉(zhuǎn)移時間三個時間控制點）等指標。（2）RNA提取和實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）：提取總RNA，將2 μl RNA溶液在核酸測定儀檢測RNA260/280 OD值，測定RNA濃度，于-80 ℃保存；將1 μl RNA及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒置入冰上融化，70 ℃水浴中孵育5 min，低速離心后42 ℃60 min，70 ℃10 min上機行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 第一鏈，反應產(chǎn)物置于-80 ℃條件下保存?zhèn)溆?。SYBR? Green Realtime PCR Master Mix反應體系（引物序列見表1），95 ℃變性60 s，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸15 s，PCR反應共40個循環(huán)。PCR擴增反應后繪制溶解曲線，應用MJ Opticon Monitor 3.0分析軟件計算得Ct值，然后以GAPDH mRNA作為內(nèi)參進行標準化，最后計算各標本RNA相對表達量。（3）Western blotting分析：提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，每個樣本取40 μg分別加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）的樣本孔中進行凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到甲醇浸泡后的PVDF膜，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min，麗春紅染液染色，5%脫脂牛奶封閉，兔抗人SATB1單克隆抗體（1∶1000）、鼠抗人Snail單克隆抗體（1∶1000）、兔抗人Slug多克隆抗體（1∶2000）、兔抗人E-cadherin多克隆抗體（1∶1500）、兔抗人Vimentin多克隆抗體（1∶500）、鼠抗人GAPDH多克隆抗體（1∶700），一抗4 ℃過夜孵育。洗滌膜3次并在室溫下與二抗孵育2 h。使用超敏型ECL化學發(fā)光顯色試劑進行顯色，用UVP凝膠成像儀檢測蛋白灰度并拍照成像。

表1 SATB1及Snail/Slug信號通路基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，相關性分析采用Spearman法，患者預后（時間依賴生存狀態(tài)，包括無瘤生存時間、局部復發(fā)時間、遠處轉(zhuǎn)移時間三個時間控制點）的相關因素行COX多因素分析，生存率影響采用Kaplan-Meier法，并制作生存曲線，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 局部復發(fā)患者與無瘤生存患者SATB1及EMT各標志基因表達比較 80例患者隨訪時間40~67個月，平均（53.6±12.6）月，無瘤生存67例，局部復發(fā)9例，遠處轉(zhuǎn)移4例（肝轉(zhuǎn)移1例、肺轉(zhuǎn)移1例，合并肝肺轉(zhuǎn)移2例），無死亡患者。局部復發(fā)患者相比無瘤生存患者切緣及區(qū)域淋巴結(jié)組織中SATB1、Snail及Slug表達明顯增加，E-cadherin表達減少，遠處轉(zhuǎn)移患者相比無瘤生存患者SATB1表達增加。RT-qPCR結(jié)果顯示：相比無瘤生存患者（SATB1、E-cadherin、Snail及Slug相對表達量分別為：3.014±0.361、1.081±0.141、2.211±0.343及2.431±0.413），局部復發(fā)患者SATB1（5.135±0.713；t=2.776，P=0.0091）、Snail（3.714±0.453；t=2.698，P=0.0094）及Slug（3.981±0.676；t=2.837，P=0.0086）表達均顯著增高，E-cadherin表達減少（0.713±0.131；t=2.031，P=0.0371）；遠處轉(zhuǎn)移患者SATB1（4.417±0.676；t=2.351，P=0.0215）表達增高，Snail（2.341±0.416）、Slug（2.576±0.348）及E-cadherin（1.098±0.067）表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。Western blotting分析結(jié)果同以上結(jié)論。

2.2 SATB1及EMT各標志基因（E-cadherin、Snail及Slug）行RT-qPCR及Western blotting檢測結(jié)果結(jié)合Spearman法檢驗時間依賴生存狀態(tài)相關性分析 （1）當預后以無瘤生存為時間控制點時，E-cadherin表達與無瘤生存時間呈正相關（r=0.817，P<0.05），SATB1表達與無瘤生存時間呈負相關（r=-0.571，P<0.05），Snail表達與無瘤生存時間呈負相關（r=-0.667，P<0.05），Slug表達與無瘤生存時間呈負相關（r=-0.883，P<0.05）；（2）當預后以局部復發(fā)為時間控制點時，E-cadherin表達與局部復發(fā)時間呈負相關（r=-0.341，P<0.05），SATB1表達與局部復發(fā)時間呈正相關（r=0.856，P<0.05），Snail表達與局部復發(fā)時間呈正相關（r=0.754，P<0.05），Slug表達與局部復發(fā)時間呈正相關（r=0.431，P<0.05）；（3）當預后以遠處轉(zhuǎn)移為時間控制點時，SATB1表達與遠處轉(zhuǎn)移時間呈正相關（r=0.616，P<0.05），見圖1。

2.3 COX多因素分析 （1）當預后以無瘤生存為時間控制點時，T分期、TNM分期、腫瘤分化程度、SATB1、Snail及Slug均為影響預后的危險因素，其中SATB1表達增加為獨立性危險因素。（2）當預后以局部復發(fā)為時間控制點時，T分期、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑（cm）、術后化療完成情況、SATB1、E-cadherin、Snail及Slug均為影響預后的危險因素，其中SATB1表達增加為獨立性危險因素。（3）當預后以遠處轉(zhuǎn)移為時間控制點時，T分期、N分期、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、術后化療完成情況、SATB1均為影響預后的危險因素，其中SATB1表達增加為獨立性危險因素。

圖1 SATB1及Snail/Slug信號通路基因表達與時間依賴生存狀態(tài)相關性分析

3 討論

傳統(tǒng)方法判斷直腸癌手術標本切緣主要基于對切緣組織的常規(guī)病理學（即細胞形態(tài)學）觀察，然而在常規(guī)病理學診斷為切緣陰性患者中，仍有10%~30%患者出現(xiàn)局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移［2］。究其原因，考慮常規(guī)病理學對形態(tài)上（或表型上）與正常細胞無可見差異的癌前細胞或具有潛在轉(zhuǎn)化能力的“正?！奔毎麩o區(qū)分能力有關，這就引出腫瘤微轉(zhuǎn)移的概念。腫瘤微轉(zhuǎn)移是指用常規(guī)影像學、病理學方法不能檢出的非血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)小簇或單個癌細胞的微小轉(zhuǎn)移灶，是多種惡性腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在因素。STAB1是人類組織特異性核基質(zhì)域DNA結(jié)合蛋白，位于人3號染色體短臂2區(qū)3帶，是人類T細胞的增殖和分化過程中一種必不可缺少的調(diào)控蛋白［3］。最近研究發(fā)現(xiàn)，SATB1表達上調(diào)與多種類型的侵襲性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤相關，包括胃癌，乳腺癌，膀胱癌，肝癌和前列腺癌等。這些結(jié)果均表明，SATB1是一個獨立的預后因素，SATB1過表達的患者常預后不佳，是研究腫瘤治療的靶點［4］。SATB1可通過介導Snail/Slug信號通路參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），在細胞分化胚胎發(fā)育過程中扮演重要的調(diào)控角色，也是影響腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移重要步驟［5］。E-cadherin是一種上皮細胞特異性標志蛋白，E-cadherin表達下調(diào)或缺失標志著腫瘤發(fā)生EMT，也是EMT過程發(fā)生的基礎與核心。

FU等［6］研究表明，惡性腫瘤可以通過構(gòu)建過表達質(zhì)粒而使SATB1表達上調(diào)，E-cadherin表達下調(diào)，并通過構(gòu)建干擾質(zhì)粒下調(diào)細胞中SATB1表達使E-cadherin表達上調(diào)，促進腫瘤向正常形態(tài)轉(zhuǎn)變，提示SATB1表達的下調(diào)可以逆轉(zhuǎn) EMT過程。本研究結(jié)果也支持這一觀點，局部復發(fā)的中低位直腸癌患者相比無瘤生存患者切緣及區(qū)域淋巴結(jié)組織中SATB1、Snail及Slug表達明顯增加，而E-cadherin表達減少；遠處轉(zhuǎn)移患者相比無瘤生存患者切緣及區(qū)域淋巴結(jié)組織中SATB1表達增加。LAMBERT等［7］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中，通過構(gòu)建過表達質(zhì)粒而上調(diào)SATB1表達可促進 E-cadherin抑制因子Snail和Slug表達，繼而抑制E-cadherin表達，最終誘發(fā)腫瘤細胞EMT發(fā)生。而TARHAN等［8］研究發(fā)現(xiàn)SATB1可促進腫瘤細胞遷移、侵襲及凋亡，并影響患者預后，與患者預后不良存在明顯相關性，促進腫瘤侵襲和進展。在本研究中，腫瘤切緣組織中E-cadherin表達與患者無瘤生存時間呈正相關，與局部復發(fā)呈負相關；而SATB1、Snail及Slug表達與患者無瘤生存時間呈負相關，與局部復發(fā)呈正相關；SATB1表達與患者遠處轉(zhuǎn)移呈正相關。表明SATB1表達增加可通過介導Snail/Slug信號通路調(diào)控直腸癌切緣腺上皮組織間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，與直腸癌浸潤和轉(zhuǎn)移潛能顯著相關。

研究表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在細胞分化過程中起重要調(diào)控作用，也是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移最重要的一步。EMT發(fā)生后，上皮細胞失去細胞極性，細胞間基質(zhì)緊密鏈接減少，細胞進而獲得間質(zhì)特性，導致細胞通路基因表達發(fā)生改變，繼而細胞形態(tài)、生物學行為發(fā)生改變，使細胞運動遷移和侵襲能力明顯增強，此種侵襲性表型細胞產(chǎn)生特異性降解蛋白酶進而降解基底膜而有利于腫瘤細胞遷移和轉(zhuǎn)移［9］。本研究中結(jié)果也支持點，COX多因素風險比例模型檢驗提示，E-cadherin表達減少、Snail及Slug表達增加主要是影響患者無瘤生存為時間及腫瘤局部復發(fā)的危險因素，但無論預后為何種時間依賴生存狀態(tài)，SATB1表達增加為獨立性危險因素。表明EMT可有效評估腫瘤微轉(zhuǎn)移，是腫瘤原位侵襲和遠處遷徙、進展的基礎。本研究僅在分子水平的基因和蛋白層面證實了直腸癌微轉(zhuǎn)移與SATB1及EMT標志基因的表達密切相關，至于SATB1是通過何種途徑誘導EMT過程，是直接調(diào)控EMT標志基因（如E-cadherin、Snail及Slug等），還是通過其他信號傳導通路介導調(diào)控EMT過程，SATB1是否在細胞生物學水平直接影響直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學行為，還有待進一步研究。

結(jié)合RT-qPCR及Western blotting在中低位直腸癌手術患者標本切緣及區(qū)域淋巴結(jié)的檢測結(jié)果及患者的預后情況，作者分析ATB1表達可能通過Snail/Slug信號通路抑制E-cadherin而介導中低位直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生。在常規(guī)病理學檢測為陰性的中低位直腸癌手術標本的切緣及區(qū)域淋巴結(jié)組織中，SATB1的過表達可作為評估患者腫瘤預后的危險因素，并進一步評估腫瘤分期分級及患者腫瘤負荷來預測組織發(fā)生腫瘤微轉(zhuǎn)移，提示患者發(fā)生腫瘤局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移風險，指導患者術后行放、化療、靶向及免疫治療等腫瘤綜合治療的必要性，為提高直腸癌個體化綜合治療精準性提供新的理論依據(jù)。