呂吉利 宣麗娜 馮丹峰 黎紅*

種植義齒具有“人類第三幅牙齒”之稱［1］，是目前最受歡迎的缺牙修復(fù)方式之一。近期研究發(fā)現(xiàn)種植術(shù)后種植體周圍炎以及種植體周圍黏膜炎發(fā)生率達(dá)19.83%和46.83%［2］，是導(dǎo)致種植體失敗的主要原因之一。種植體-軟組織界面的結(jié)締組織具有支持、免疫監(jiān)控、促進(jìn)修復(fù)等作用［3］，研究表明種植體周圍軟組織封閉水平弱于天然牙［4］，這種較弱的軟組織封閉水平可能是導(dǎo)致種植體失敗的原因之一。整合素作為牙齦成纖維細(xì)胞黏附過(guò)程中重要的蛋白，較多研究證實(shí)通過(guò)不同的種植體表面處理方式可以促進(jìn)整合素的基因表達(dá)，其中物理改性是較為安全穩(wěn)定的方法之一［5］。本文探討不同粗糙度鈦表面形貌對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞黏附及整合素α5基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 無(wú)水乙醇、蒸餾水、37%濃鹽酸、濃硫酸、氧化鋁細(xì)砂（綠新源）、鈦圓盤(pán)（柏泰）、PBS溶液（諾森德）、0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（四季青）、CCK8試劑盒（碧云天）、DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)）、Trizol（Takara）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara RR047）、PCR試劑盒（Takara RR420）。

1.2 試件制備及表征 將直徑15 mm、高度1 mm的100枚鈦圓盤(pán)隨機(jī)分為A組、B組、C組及D組，A組采用機(jī)械拋光處理，記為T(mén)i組，B組、C組及D組分別采用直徑45 μm、125 μm及250 μm的氧化鋁細(xì)砂進(jìn)行表面噴砂處理（JNSP-Ⅰ型濕噴砂機(jī)，壓力：0.4 MPa，距離7 cm，時(shí)長(zhǎng)：1 min）。將所得鈦圓盤(pán)經(jīng)蒸餾水沖洗、超聲20 min后進(jìn)行熱酸蝕處理。B組采用低濃度混合酸（60% H2SO4：10% HCL：蒸餾水按1∶1∶2混勻）100 ℃水浴20 min，蒸餾水沖洗后分別經(jīng)蒸餾水、75%乙醇、蒸餾水超聲10 min，高溫高壓蒸汽滅菌后保存?zhèn)溆?，記為T(mén)i45組。C組及D組采用高濃度混合酸（50% H2SO4∶10% HCL按1∶1混勻）100 ℃水浴20 min，蒸餾水沖洗后分別經(jīng)蒸餾水、75%乙醇、蒸餾水超聲10 min，分別記為T(mén)i125組及Ti250組，高溫高壓蒸汽滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 從4組試件中分別隨機(jī)抽取5枚鈦圓盤(pán)，每枚鈦圓盤(pán)分別選取上中下三個(gè)測(cè)試位點(diǎn)，利用探針式輪廓測(cè)試儀檢測(cè)表面粗糙度（Ra）。記錄后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 牙齦成纖維細(xì)胞獲得 在經(jīng)過(guò)志愿者知情同意后，取因正畸或阻生齒需拔牙或需冠延長(zhǎng)手術(shù)且牙齦無(wú)炎癥患者（12~35歲）的牙齦組織（經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)）。采用改良組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，5 d左右觀察細(xì)胞爬出后更換含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)液并去除漂浮組織塊及雜質(zhì)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時(shí)常規(guī)按1∶2傳代，3~5代細(xì)胞采用含10% DMSO的胎牛血清凍存于液氮中備用。

1.5 細(xì)胞分離率 將消毒后鈦圓盤(pán)試件治愈超凈工作臺(tái)上紫外燈照射下過(guò)夜，每組取6個(gè)鈦圓盤(pán)放置于24孔板中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3~6代細(xì)胞以3×104/ml濃度接種至24孔板內(nèi)，每孔1 ml，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)24 h培養(yǎng)穩(wěn)定后，小心吸出原培養(yǎng)液并用PBS溶液沖洗后吸凈，加入稀釋后的0.125%的胰酶溶液1 ml，并于搖床上以150 r/min速度作用1 min，培養(yǎng)液終止消化，小心吸出四組液體分別移入EP管中，剩余鈦片上再次加入1 ml稀釋胰酶溶液，作用1 min后終止消化，并用1000 ml移液槍反復(fù)吹打鈦圓盤(pán)，收集剩余四組液體，將2次液體1500 r/min、5 min離心，棄上清液，重復(fù)3次，每支EP管中加入200 μl培養(yǎng)液，小心吹打均勻，并接種于96孔板中，置入CO2培養(yǎng)箱中，24 h后細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，吸出原培養(yǎng)液，加入PBS小心清洗并吸凈，每孔加入100 μl DMEM培養(yǎng)液及10 μl CCK8試劑，周圍空白孔用100 μl培養(yǎng)液充填，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處吸光度OD值，重復(fù)測(cè)量3次，將初始消化后OD值記為A1，最終消化后OD值記為A2，并按照公式計(jì)算細(xì)胞分離率：細(xì)胞分離率=A1/（A1+A2）×100%。分離率與黏附強(qiáng)度成反比，細(xì)胞黏附強(qiáng)度可進(jìn)一步計(jì)算經(jīng)胰酶及搖床處理后存留在鈦圓盤(pán)的細(xì)胞量與總細(xì)胞量比值表示，按公式進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞黏附強(qiáng)度=A2/（A1+A2）×100%。

1.6 整合素α5的mRNA表達(dá) 相同加工方法制作直徑為15 mm的各組試件，消毒后置于24孔板中，每組5個(gè)孔，每孔接種HGF 3×104個(gè)，培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定。鈦片試件用新鑷子小心移至新24孔板中，PBS沖洗，吸干，每孔加200 μl Trizol，收集每組5個(gè)孔的trizol裂解液至EP管中，抽提總RNA，Nano Drop 2000測(cè)定各組總RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，按照Takara RR420條件要求嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR），各引物序列及大小見(jiàn)表1。重復(fù)3次/組，每次每組每基因3個(gè)復(fù)孔。LightCycler 480軟件導(dǎo)出各組CT值。以光滑鈦組為對(duì)照組，采用2-△△CT法計(jì)算整合素α5的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 四組材料表面粗糙度比較 見(jiàn)表2。

表2 四組材料表面粗糙度比較（±s）

表2 四組材料表面粗糙度比較（±s）

注：與Ti組比較，*P<0.05；與Ti45組比較，#P<0.05；與Ti125組比較，△P<0.05；與Ti250組比較，▲P<0.05

組別 n 粗糙度（μm）Ti組 10 0.09±0.03#△▲Ti45組 10 0.47±0.03*△▲Ti125組 10 1.65±0.05*#▲Ti250組 10 2.93±0.06*#△

2.2 四組掃描電鏡觀察結(jié)果 Ti組鈦試件并非完全光滑，其表面可見(jiàn)細(xì)微劃痕分布。其余三組粗糙表面可見(jiàn)大量微米級(jí)凹坑分布，呈兩級(jí)分布，較大的一級(jí)凹坑及較小的二級(jí)凹坑。二級(jí)凹坑均勻分布于一級(jí)凹坑內(nèi)或一級(jí)凹坑間。Ti45組表面一級(jí)凹坑較小，直徑大約2 μm，而Ti250組表面一級(jí)凹坑直徑較大，約2~3 μm，Ti125組位于兩組之間。見(jiàn)圖1。

圖1 四組材料掃描電鏡觀察（×5000）

2.3 四組細(xì)胞黏附強(qiáng)度比較 Ti組細(xì)胞黏附強(qiáng)度高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4 四組HGF整合素α5 mRNA表達(dá)比較 Ti組、Ti45組、Ti125組及Ti250組整合素α5的mRNA表達(dá)量依次降低，且Ti組高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 四組黏附強(qiáng)度比較

圖3 四組整合素mRNA表達(dá)情況

3 討論

隨著研究的不斷深入，對(duì)于種植體周圍病的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步加深?？谇粌?nèi)擁有超過(guò)10,000種細(xì)菌表型［6］，細(xì)菌的大量聚集會(huì)導(dǎo)致種植體周圍黏膜炎甚至種植體周圍炎的發(fā)生，如何加強(qiáng)種植體周圍軟組織封閉作用成為目前的研究熱點(diǎn)。表面改性是增強(qiáng)軟組織黏附作用的有效方法［7］，陽(yáng)極氧化、光功能化、微弧氧化、微溝槽處理、噴砂酸蝕法等是目前研究的主要方向［8］，哪種方法最有效目前尚未有定論。表面形貌對(duì)于細(xì)胞黏附、爬行及生長(zhǎng)具有重要影響，而表面粗糙度是表面形貌的重要指標(biāo)之一。有研究認(rèn)為微粗糙的表面增加表面能及表面積，更易于體液中的大分子物質(zhì)沉積吸附，從而增加細(xì)胞的黏附點(diǎn)［9］。本課題組通過(guò)噴砂酸蝕法成功獲得具有四種典型粗糙度的鈦圓盤(pán)試件，各組間粗糙度差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

牙槽骨是終生處于動(dòng)態(tài)變化的，種植體邊緣骨受生理及病理因素的影響而出現(xiàn)吸收，為了維持生物學(xué)寬度導(dǎo)致結(jié)合上皮的根向遷移。HERMANN［10］通過(guò)X線片發(fā)現(xiàn)種植體邊緣骨在Ⅱ期手術(shù)暴露種植體及安放愈合基臺(tái)后會(huì)發(fā)生改建，導(dǎo)致邊緣牙槽骨吸收至種植體-基臺(tái)界面下方，為了維持種植體生物學(xué)寬度的穩(wěn)定，軟組織隨之改建，導(dǎo)致上皮根向遷移，經(jīng)過(guò)這一系列的改建，結(jié)締組織最終部分或全部遷移至種植體粗糙頸部。目前為了獲得良好的骨結(jié)合，絕大多數(shù)種植體采用經(jīng)過(guò)各種表面處理得到的粗糙表面，Straumann公司提出大顆粒噴砂酸蝕法得到的粗糙SLA表面形貌是目前主流的種植體表面之一。尋找一種合適粗糙度的種植體表面在不影響骨結(jié)合的同時(shí)增強(qiáng)軟組織黏附及減少菌斑附著具有重要意義。

目前研究發(fā)現(xiàn)種植體周圍軟組織愈合與天然牙的軟組織屏障存在明顯不同。種植體周圍的軟組織愈合形式實(shí)際上是一種異物反應(yīng)，最終形成類似于“瘢痕”組織［11］，對(duì)于機(jī)械力的抵抗作用更弱。KOKUBU［12］研究表明SLA表面可以增強(qiáng)牙齦成纖維細(xì)胞的黏附，但也有學(xué)者［13］認(rèn)為光滑表面更利于成纖維細(xì)胞的黏附鋪展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，相比于粗糙表面，較為光滑的Ti組表面的牙齦成纖維鋪展面積更大，細(xì)胞相互連接成網(wǎng)狀，而粗糙表面細(xì)胞則生長(zhǎng)方向各異，鋪展面積不如光滑表面，但細(xì)胞呈三維立體狀黏附于材料表面，這導(dǎo)致細(xì)胞需要更多時(shí)間適應(yīng)粗糙表面，且不利于細(xì)胞的爬行［14］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞分離率發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細(xì)胞在低粗糙度的Ti組表現(xiàn)出更強(qiáng)的黏附能力。表明表面形貌導(dǎo)致細(xì)胞鋪展形式不一，Ti組細(xì)胞鋪展更完全，利于細(xì)胞的黏附，與前期掃描電鏡下觀察到的細(xì)胞鋪展情況相一致。

整合素是存在于細(xì)胞膜表面的一種跨膜蛋白，由α亞基及β亞基組成的異質(zhì)二聚體，目前研究發(fā)現(xiàn)18種α亞基及8種β亞基［15］，幾乎所有細(xì)胞表面都存在至少一種整合素。成纖維細(xì)胞表面主要表達(dá)整合素α5β1亞型。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)整合素可能通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架系統(tǒng)形成雙向的力學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)［16］。表面形貌的改變會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的力學(xué)刺激，通過(guò)整合素向內(nèi)傳導(dǎo)影響相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架使細(xì)胞產(chǎn)生形變并影響細(xì)胞的黏附［17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ti組整合素α5的mRNA表達(dá)明顯高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這可能與粗糙表面主要以微米級(jí)形貌改變相關(guān)，對(duì)于牙齦成纖維細(xì)胞的形態(tài)改變影響較大，細(xì)胞鋪展面積減少導(dǎo)致細(xì)胞黏附點(diǎn)減少，進(jìn)而導(dǎo)致整合素α5的mRNA表達(dá)減少。此外，親水性可能也是導(dǎo)致整合素α5基因表達(dá)降低的原因。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著粗糙度的增加，親水性降低［14］，而親水性的降低會(huì)導(dǎo)致體液中的蛋白等基質(zhì)的吸附降低，而成纖維細(xì)胞的黏附需要通過(guò)整合素等與細(xì)胞外基質(zhì)的特異性位點(diǎn)識(shí)別并結(jié)合，因此可能導(dǎo)致整合素α5的表達(dá)降低。

綜上所述，在四組不同粗糙度鈦試件組中，Ti組（Ra=0.09±0.03 μm）牙齦成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的黏附強(qiáng)度，過(guò)度增加粗糙度不利于牙齦成纖維細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)。通過(guò)RTq-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著粗糙度的增加，整合素α5的基因表達(dá)降低，且Ti組整合素α5表現(xiàn)出較高的基因表達(dá)水平（P<0.05），推測(cè)由于粗糙度的增加導(dǎo)致親水性降低有關(guān)。同時(shí)有學(xué)者［18-19］提出納米級(jí)或微納米級(jí)表面對(duì)于牙齦成纖維細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用。未來(lái)將進(jìn)一步研究納米級(jí)表面形貌對(duì)于牙齦成纖維細(xì)胞黏附及相關(guān)基因表達(dá)的影響。