王 丹，何 怡，趙明義，陳長(zhǎng)蘭

(1.遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽110036；2.遼寧省沈陽市兒童醫(yī)院 輸血科，遼寧 沈陽 110032；3.遼寧大學(xué) 輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

近年來，谷物中的天然化學(xué)物質(zhì)憑借其安全可靠的食物來源及優(yōu)良的保健作用而受到消費(fèi)者和科研工作者的關(guān)注和青睞.燕麥(Avena sativa L.)是全谷物進(jìn)食的谷物，其獨(dú)特成分—燕麥生物堿(Avenanthramide)具有優(yōu)良的抗氧化活性、抗炎活性、降血糖和抗腫瘤細(xì)胞增殖等多種藥理活性，現(xiàn)多應(yīng)用于防過敏和止癢的治療[1].

1 燕麥生物堿的分布

燕麥生物堿又稱燕麥蒽酰胺，是一種植物次生代謝物質(zhì)，僅存在于燕麥谷物和蠶卵中，存在于燕麥的葉片組織、小穗組織及其籽粒中，其中，燕麥麩皮與次級(jí)糊粉層中因有高含量的生物堿(300 mg/kg)而被廣泛應(yīng)用[2-5].燕麥生物堿含量和種類根據(jù)燕麥品種的變化而變化，其中冠銹病高抗品種的燕麥中生物堿的含量較多[1，6-8].

2 燕麥生物堿的結(jié)構(gòu)及其構(gòu)效關(guān)系

2.1 燕麥生物堿的結(jié)構(gòu)

已發(fā)現(xiàn)有40余種燕麥生物堿，燕麥生物堿是一系列由酰胺鍵連接鄰氨基苯甲酸及其衍生物與肉桂酸及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中含量較多的是燕麥生物堿A、B和C，分別占燕麥生物堿的35%、21%和 44%[9]，結(jié)構(gòu)如表1所示[10].

表1 燕麥生物堿A、B和C的結(jié)構(gòu)

2.2 燕麥生物堿的溶解性

燕麥生物堿的提取用丙酮萃取燕麥，所得到的淡黃色或黃綠色的粉末晶體產(chǎn)物熔點(diǎn)約200 ℃[11].燕麥生物堿可部分溶解在乙酸乙酯、水與低元醇混合液等極性溶劑中；在氯仿、苯等非極性溶劑中溶解較少；部分生物堿可在堿性條件下溶于冷水[11].

2.3 燕麥生物堿的穩(wěn)定性

燕麥生物堿的穩(wěn)定性受不同存儲(chǔ)和加工條件影響.因酚類化合物的穩(wěn)定性和活性主要受溫度和pH的影響[12-13]：過高的溫度可使酚類物質(zhì)分解從而降低活性[13-14]；另有研究表明，pH的升高有利于增加燕麥生物堿B、C的活性，而燕麥生物堿A可能由于結(jié)構(gòu)中缺少肉桂酸及其衍生物而無這一特性[13，15].

2.4 燕麥生物堿的構(gòu)效關(guān)系

研究表明燕麥生物堿的抗氧化能力與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)性較明確[13，16]，主要因素包含以下三點(diǎn)[13，16]：

1)生物堿的抗氧化活性可根據(jù)鄰氨基苯甲酸上的取代基不同而改變：咖啡酸>芥子酸>阿魏酸>P-香豆素(3，4-二羥基)>4-羥基-3，5-二甲氧基>4-羥基-3-甲氧基>4-羥基肉桂酸；

2)生物堿結(jié)構(gòu)中的超共軛效應(yīng)也影響其抗氧化活性：苯環(huán)上的羥基是保持抗氧化作用所必需的結(jié)構(gòu)，在任一苯環(huán)羥基的鄰位有穩(wěn)定基團(tuán)可提高其抗氧化活性；

3)延長(zhǎng)雙鍵體系和提供功能基團(tuán)(芳香環(huán)鄰、對(duì)位上存在供電子基團(tuán))可增強(qiáng)其抗氧化能力.

3 燕麥生物堿的合成方法

3.1 燕麥生物堿的生物合成

應(yīng)用苯丙氨酸其衍生物酪氨酸的生物合成途徑是燕麥生物堿生物合成的最常見方法[17].合成過程中，有三種起關(guān)鍵作用的酶[17-18]：苯氨酸解氨酶(PAL)、輔酶A連接酶(4CL)和羥基-肉桂酰輔酶A(HHT).首先，PAL催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成β-苯丙烯酸，促進(jìn)生成次生代謝物例如生物堿、花色素、黃酮等[19]；然后苯丙烷類代謝途徑的限速酶4CL參與對(duì)香豆素生成對(duì)香豆輔酶A的過程，該產(chǎn)物是燕麥生物堿的前體物質(zhì)；最后HHT參與催化縮合對(duì)氨基苯甲酸(PABA)和HHT酯合成生物堿[19].

3.2 燕麥生物堿的化學(xué)合成

以5-羥基氨茴酸與丙二酸環(huán)異丙酯反應(yīng)合成2-(2-羧基乙酰氨基)-5-羥基苯甲酸，以2-氨基苯甲酸甲酯和丙二酸環(huán)異丙酯反應(yīng)合成2-(2-羧基乙酰氨基)苯甲酸，所得產(chǎn)物分別與對(duì)羥基苯甲醛、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛、3，4-二羥基苯甲醛等發(fā)生Knoevenagel縮合反應(yīng)合成燕麥生物堿A、B、C[20].

4 燕麥生物堿的分離提取方法

結(jié)合燕麥生物堿的物理性質(zhì)和反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來看，燕麥生物堿的提取方法有溶劑提取法、超臨界CO2流體萃取法、層析法、索氏提取法和膜提取法等，本文主要介紹溶劑提取法、超臨界CO2流體萃取法還有層析法.

4.1 溶劑提取法

由于燕麥生物堿化學(xué)性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、在堿性條件下穩(wěn)定，為了保持其活性穩(wěn)定，適合采用選擇性較高的溶劑提取法來進(jìn)行分離提取[11].吳玉杰[21]等建立且優(yōu)化了乙醇浸提法制備燕麥生物堿的方法：乙醇體積分?jǐn)?shù)是80.88%，料液比(g/mL)1∶20，提取時(shí)間2.05 h，提取溫度61.86 ℃.燕麥總生物堿粗提后的平均提取率達(dá)15.88%，經(jīng)AB-8大孔純化后得率為21.88%.目前，運(yùn)用醇類溶劑提取植物的生物堿較為普遍[22]，缺點(diǎn)是此法費(fèi)用高昂，且易燃易爆、效率低且不利于環(huán)保等問題.

4.2 超臨界CO2流體萃取法

超臨界CO2流體萃取法(SFE)是根據(jù)壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解度的影響來提取物質(zhì)的操作，其中CO2便宜且方便操作，不僅可以防止被提取物質(zhì)被氧化、不造成溶劑污染，而且可以循環(huán)利用節(jié)約成本.該法可以有效提取生物堿，并且可以通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)來確定最佳工藝參數(shù)，已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn).馬亦顏[23]采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)，進(jìn)行考察條件為萃取壓力、溫度、時(shí)間的單因素試驗(yàn)，和中心點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)麩皮中的燕麥生物堿的提取條件進(jìn)行優(yōu)化：萃取壓力21.2 MPa，萃取溫度0.4 ℃，萃取時(shí)間1.46 h，萃取量達(dá)655.8 μg/g.

4.3 層析法

層析法是根據(jù)混合物中各成分的化學(xué)性質(zhì)以及溶解度不同，使各組分分別在固定相和流動(dòng)相中分布的提取方法.其中，大孔樹脂通過類似活性炭分子篩選的物理篩選，吸取混合物中的有機(jī)成分，達(dá)到分離純化的目的.任貴興等[24]對(duì)麩皮中燕麥生物堿的提取條件進(jìn)行優(yōu)化：最佳提取參數(shù)為溫度60 ℃，提取時(shí)間2 h，溶劑為乙醇/水/冰醋酸(80/19.9/0.1)，料液比1∶8，此條件下得率為5.29%，經(jīng)樹脂純化后粗提物中生物堿純度達(dá)19.2%.應(yīng)用大孔吸附樹脂提取生物堿時(shí)，不僅價(jià)格低廉、操作方便、樹脂可反復(fù)再生利用，而且產(chǎn)物穩(wěn)定性.

5 燕麥生物堿的藥理活性

5.1 抗氧化活性

燕麥生物堿可通過減少體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)預(yù)防癌癥和肥胖、心血管疾病等慢性病.燕麥生物堿可以提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物分解酶(GSH-Px)的活性[25-27]，減少脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，降低血總膽固醇(TCHO)和低密度膽固醇(LDL)水平[11，28]，增加脂蛋白酶的表達(dá)[11，26]，由氧化應(yīng)激系統(tǒng)(ROS)造成的細(xì)胞損傷也可以被有效治療.燕麥中的生物堿提取物(ARE)對(duì)過氧化叔丁基(t-BHP)刺激作用能顯著降低HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平.且燕麥生物堿通過抑制Keap1的表達(dá)，誘導(dǎo)Nrf2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，從而導(dǎo)致了上調(diào)了小鼠的γ-GCS和NQO1燕麥生物堿可以通過清除自由基來避免t-BHP損傷細(xì)胞，并誘導(dǎo)Nrf2通路激活[29].

5.2 抗炎活性

燕麥生物堿通過與細(xì)胞因子的相互作用和信號(hào)通路介導(dǎo)炎癥細(xì)胞反應(yīng).研究表明，燕麥生物堿可通過下調(diào)抑制蛋白激酶(IKK)和抑制蛋白(IκB)的表達(dá)[30]，防止IκB磷酸化進(jìn)而降低內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng).燕麥生物堿也可下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附因子-1(VCAM-1)和E-selection的表達(dá)，從而抑制單核細(xì)胞黏附因子作用，顯著抑制白介素(IL)-1β刺激人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)前炎性細(xì)胞活素的分泌：IL-6、IL-8和MCP-1[31]，NF-κB的激活被證實(shí)是與這些前炎性細(xì)胞活素的表達(dá)有關(guān)[32-33].最近研究表明，一種合成的燕麥生物堿的類似物(DHAv)，可以通過抑制核基因NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)胰腺β細(xì)胞受到損傷[34].

5.3 抗增殖作用

燕麥生物堿的結(jié)構(gòu)與曲尼司特(Tranilast)相似[35]，其預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來調(diào)節(jié)蛋白p53、p21cipl、p7kipl、D1和pRb表達(dá)，進(jìn)而抑制使細(xì)胞周期阻滯在G1/S期，從而防止血管平滑肌細(xì)胞增殖[36-37].有研究發(fā)現(xiàn)ARE以及合成的ARE，均可以有效抑制結(jié)腸腫瘤、前列腺腫瘤和乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖，其中對(duì)結(jié)腸中立于細(xì)胞的抑制作用最明顯[38].

燕麥生物堿在氮氧甲烷/硫酸葡聚糖鈉(AOM/DSS)小鼠結(jié)腸癌模型中顯著減弱了腫瘤的形成，其中燕麥生物堿A治療觸發(fā)了人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞衰老機(jī)制，表現(xiàn)為細(xì)胞體積變大、上調(diào)半乳糖苷酶活性、h-H2AX陽性染色和G1期阻滯，燕麥生物堿A處理顯著增加了miR-129-3p的表達(dá)，顯著抑制了E3泛素連接酶Pirh2和其他兩個(gè)靶點(diǎn)IGF2BP3和CDK6.miR-129-3p沉默Pirh2導(dǎo)致p53及其下游靶點(diǎn)p21蛋白水平顯著升高，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞衰老[39].

進(jìn)一步研究表明，燕麥生物堿治療可顯著降低人結(jié)直腸腫瘤(CRC)組織中高度表達(dá)的致癌RNA解旋酶DDX3的表達(dá).DDX3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了ROS介導(dǎo)的AVNs誘導(dǎo)的CRC凋亡.燕麥生物堿A通過直接結(jié)合DDX3中的Arg287和Arg294殘基，阻斷了DDX3的ATP酶活性并誘導(dǎo)其降解[40].

5.4 血管舒張作用

燕麥生物堿通過一氧化氮(NO)來舒張血管，其機(jī)制是：燕麥生物堿可增加血管內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞NO合成酶的表達(dá)水平，釋放出大量的NO，從而舒張血管，促進(jìn)血液循環(huán)[41].

5.5 抗過敏作用

臨床上，燕麥一直被用于治療曬傷、濕疹等皮膚疾病，ARE也經(jīng)證實(shí)有抗組胺和抗過敏活性[1，42].燕麥生物堿有抗過敏活性是通過抑制組胺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的.研究表明，低濃度的燕麥生物堿(10-6mg/mL)可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中NK-κB的活化，減少炎性細(xì)胞因子IL-8的釋放[11，43].燕麥生物堿C(1-100 nm)抑制免疫球蛋白(Ig)刺激的肥大細(xì)胞脫顆粒，抑制磷酸化的磷酸肌醇3激酶和磷脂酶C，并降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平[44].

5.6 抗糖尿病作用

胰島細(xì)胞或者RINm5F胰島瘤細(xì)胞經(jīng)過二氫燕麥生物堿D處理過后NO水平下降，誘導(dǎo)型NO合酶表達(dá)下降，有效保護(hù)胰島β-細(xì)胞[45]，有希望治療Ⅰ型糖尿病.

5.7 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

有研究發(fā)現(xiàn)，體外實(shí)驗(yàn)證明燕麥生物堿可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Nrf2誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡[46].此外，研究表明燕麥生物堿C可誘導(dǎo)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的凋亡[11，47]，因此有望充當(dāng)化療藥物，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

6 展望

截至目前，已發(fā)現(xiàn)燕麥中有40余種生物堿，已探明的燕麥生物堿主要有抗氧化、降糖、抗細(xì)胞增殖、抗過敏、抗炎等藥理活性，但燕麥生物堿對(duì)于抗腫瘤和治療糖尿病等活性的具體機(jī)制仍不明朗，可以結(jié)合疾病的靶點(diǎn)和通路，深入研究為疾病提供更多治療方案.此外，燕麥生物堿的多種結(jié)構(gòu)也可進(jìn)行單體的分離純化和工藝優(yōu)化，為發(fā)現(xiàn)更多藥理活性奠定基礎(chǔ).