李芳蓉，劉玲玲，牛娟，張建軍，趙云峰，韓秀鳳

(甘肅中醫(yī)藥大學 藥學教學部，甘肅 定西 743000)

0 引言

甘肅省是我國中藥材生產(chǎn)大省，定西市譽為“千年藥鄉(xiāng)”，盛產(chǎn)各種中藥材，中藥材為地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展和民眾生活水平的提高做出了重要貢獻.市轄岷縣為“中國當歸之鄉(xiāng)”.當歸是本市主要道地中藥材，譽為“岷歸”，種植歷史悠久，品質(zhì)優(yōu)良，全市所產(chǎn)當歸產(chǎn)量占全省的 90%和全國的70%[1]，岷縣成為國際和國內(nèi)當歸藥材的主產(chǎn)區(qū)和供應(yīng)區(qū)[2].據(jù)初步調(diào)查，道地藥材當歸、黨參等貯藏養(yǎng)護的技術(shù)和方法欠科學，霉爛蟲蛀問題十分嚴重，影響藥材質(zhì)量，經(jīng)濟損失巨大，直接降低藥材的安全有效性.隨著生活水平提高和保健意識增強，藥食同源藥材當歸的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大和市場需求量逐年遞增，受市場等因素的影響也越來越大，庫存量也隨之加大，貯藏期間發(fā)生霉變、泛油、變色、變茬和受倉貯害蟲的危害也日益嚴重[3].據(jù)調(diào)查，當歸是甘肅省受倉儲害蟲危害最嚴重的中藥材之一[1].

1 當歸綠色科學養(yǎng)護的重要性和迫切性

當歸為傘形科植物當歸[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]的干燥根[4].其味甘、辛、微苦，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)[5-6].有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥通便之功效，常見于多種類型的遣藥組方中，其藥用價值趨向于多樣化[7]，是常用大宗藥材之一.始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，屬無毒上品藥，素有“十方九歸”之美譽[8].臨床用含當歸藥物多達80余種，亦可作為滋補品食用.

因當歸中含有較多的多糖類成分，貯藏過程中經(jīng)常會被蟲蛀，發(fā)霉，泛油，散發(fā)異味等.導致藥材腐爛變質(zhì)，降低臨床用藥的安全性和有效性，造成巨大的浪費和經(jīng)濟損失；同時，當歸富含的揮發(fā)油類成分，在長時間貯藏中逐漸減少.目前對于當歸的貯藏養(yǎng)護，大多仍沿用傳統(tǒng)的硫磺熏蒸陰干法，防止當歸發(fā)霉和蟲蛀，減少貯藏期有效成分的消耗[9].雖然硫熏防霉防蟲蛀效果好，硫磺熏蒸會在一定程度上影響藥物療效且對人體造成傷害[10].尤其若過度使用會造成其化學成分和藥理作用的改變及殘留超標[11-12]，因而研究當歸的科學綠色貯存及防霉防蟲養(yǎng)護成為亟待解決的問題.

2 超聲波及其聯(lián)用技術(shù)

2.1 超聲波技術(shù)

超聲波頻率高、波長短、方向性好、穿透力強，具有特殊的物理性能，安全性高，無化學殘留，使用便捷.超聲波技術(shù)在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生、生物技術(shù)、食品工業(yè)和環(huán)境保護等方面發(fā)揮著重要作用[13-14].超聲清洗主要利用超聲空化效應(yīng)對物體表面污物撞擊剝離.超聲波對微生物具有殺滅作用的原因是空化效應(yīng)能夠擾亂微生物細胞生命活動，也使得細菌對殺菌劑更為敏感[15].超聲清洗中藥材快速徹底，不留死角，且空化效應(yīng)能在細胞液與細胞壁間產(chǎn)生微射流及局部高熱高壓，抑制蟲卵，強烈殺滅細菌、霉菌、病菌等[16]，能實現(xiàn)節(jié)水環(huán)保，快速洗滌，有效保護中草藥，同時，經(jīng)超聲清洗中藥材干燥時間明顯縮短[17-18].超聲波清洗中藥材省時省力，清潔度高，中藥材有效成分損失量少[19]，是理想的中藥材清洗方法[20-21].將當歸藥材在貯藏保存前預(yù)先進行超聲波清洗，提前消除隱患，有利于后期的貯藏養(yǎng)護，是科學綠色當歸養(yǎng)護的技術(shù).

2.2 天然抑菌防腐性環(huán)境友好高分子

天然抑菌防腐性環(huán)境友好高分子在果蔬保鮮中的應(yīng)用較多.殼聚糖具有良好的抑菌活性、環(huán)保性、成膜性、通透性、生物降解性、生物相容性及抗菌譜廣等特點，是一種潛力巨大的新型天然防腐劑.殼聚糖與高分子和離子性復(fù)合物可形成凝膠，成膜，廣泛應(yīng)用于食品保藏和水果保鮮[22].水溶性殼聚糖在酸性介質(zhì)中具有更好的抑菌性能[23].殼聚糖可以在貯藏期內(nèi)有效對中藥材防霉防蛀[24].魔芋葡甘聚糖是一種可再生的天然高分子多糖，溶于水后能形成高黏度的假塑性溶液，具有黏性、穩(wěn)定性、成膜性、凝膠性、抗菌性及可食性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，可作為膜液原料廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的貯藏保鮮[25]，在可食用膜的制作方面應(yīng)用前景廣闊[26-27].甘露聚糖是一種既經(jīng)濟又高效的天然食品防腐劑，其無色、無毒、無異味能有效地防止食品腐敗變質(zhì)發(fā)霉和遭受蟲害，可用于水果、蔬菜、豆制品、蛋類以及魚類等食品的保鮮貯藏[28-29].將當歸貯藏前預(yù)先超聲清洗，再利用超聲波的分散作用，在當歸藥材表面均勻的涂布一層天然抑菌性環(huán)境友好高分子，使當歸藥材與外界環(huán)境隔離，阻斷貯藏期霉菌、細菌和病毒的侵蝕，具有安全、高效、無化學污染的特點，是綠色科學的當歸藥材貯藏養(yǎng)護技術(shù).

2.3 紫外線殺菌消毒技術(shù)

紫外線(UV-C)處理是無化學污染的物理處理法，一方面，UV-C可誘導其相關(guān)酶如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等產(chǎn)生，提高果蔬抗病性，減少采摘后的腐爛及其產(chǎn)生的經(jīng)濟損失；另一方面，使用紫外線消毒，可減少各種化學保鮮劑的使用，屬于綠色環(huán)保的貯藏保鮮途徑[30-31].同時，空氣中的O2在紫外線照射下可產(chǎn)生一定量具有更強氧化性的O3，進一步增強其抑菌消毒效果.紫外線消毒機理是利用其較強的化學效應(yīng)，以容易穿透生物細胞壁的200～280 nmUV-C照射待消毒物品，破壞生物機體細胞中的DNA或RNA分子結(jié)構(gòu)，使細胞死亡，從而達到殺菌消毒效果.將當歸藥材貯藏前預(yù)先超聲清洗，再用UV-C照射，即利用超聲-UV聯(lián)用技術(shù)養(yǎng)護當歸，是科學綠色的貯藏養(yǎng)護技術(shù).

2.4 O3滅菌消毒技術(shù)

O3具有強氧化性，是一種安全、環(huán)保、高效、無殘留的新興滅菌劑，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、生產(chǎn)生活等各領(lǐng)域.研究表明O3具有明顯滅菌、殺蟲效果和一定的除異味作用，對儲糧和環(huán)境無污染[32].但O3濃度與滅菌殺蟲效果的關(guān)系、O3濃度的檢測等有待進一步研究.將其應(yīng)用到中藥材的貯藏養(yǎng)護中，0.3 mg/L 的O3水能提高藥材活性物質(zhì)的含量，提高幅度與藥用植物的器官有關(guān)[33-34].O3滅菌過程機理為生物化學過程，能氧化分解細菌內(nèi)部所必須的葡萄糖氧化酶，直接破壞細菌病毒的細胞器和核糖核酸，分解DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)類和多糖等大分子聚合物，破壞細菌的物質(zhì)產(chǎn)生、代謝及繁殖.能滲透胞膜組織，侵入細胞膜內(nèi)作用于外膜脂蛋白和內(nèi)部脂多糖，使細胞通透畸變，溶解死亡[35]，并且將死亡菌體內(nèi)遺傳基因、寄生菌種、寄生病毒粒子、噬菌體、枝原體及熱原(細菌病毒代謝產(chǎn)物、內(nèi)毒素)等溶解變性滅亡[36].O3滅菌屬于溶菌，能徹底、永久地消滅物體表面所有微生物.將當歸藥材貯藏前預(yù)先超聲清洗后，再進行O3滅菌處理，即利用超聲-O3聯(lián)用養(yǎng)護，是科學綠色的當歸藥材貯藏養(yǎng)護技術(shù).

3 超聲波聯(lián)用技術(shù)養(yǎng)護當歸后養(yǎng)護效果的評價

3.1 待檢藥效成分選定

選擇確定了當歸的指標性或代表性藥效成分，作為超聲波聯(lián)用技術(shù)養(yǎng)護當歸藥材后評價養(yǎng)護效果的待檢藥效成分.當歸的主要有效成分為阿魏酸、當歸多糖、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞和丁基苯酞[37]等.其中阿魏酸是當歸主要水溶性活性成分，常作為當歸質(zhì)量鑒定的標志性化合物，《中國藥典》2020年版規(guī)定，阿魏酸為當歸藥材的檢測指標.阿魏酸具有抑制血小板聚集、抗血栓及心臟保護等藥理活性[38-39]，能清除自由基和促進清除自由基酶的產(chǎn)生，增強谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶和醌還原酶的活性，并抑制酪氨酸酶活性，調(diào)節(jié)人體生理機能，具有抗抑郁和抗老年癡呆作用.藁本內(nèi)酯是當歸中重要活性成分，是公認的鑒定當歸真?zhèn)魏驮u定其質(zhì)量的特征指標之一[40].有很強的解痙、平喘、鎮(zhèn)靜作用，能改善微循環(huán)，松弛平滑肌，抑菌，提高機體免疫調(diào)節(jié)功能，具有抗動脈粥樣硬化、神經(jīng)保護、抗癌、抑制心肌肥大、抗炎、鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理活性[41].丁烯基苯酞和丁基苯酞具有擴張血管、改善腦部微循環(huán)、抗心肌缺血缺氧和抗抑郁等功效[42]，也是當歸的主要藥理活性成分.當歸多糖是當歸主要水溶性成分，具有促進造血、增強免疫功能、抗腫瘤、抗輻射損傷的藥理作用和生物活性[43].

3.2 待檢藥效成分分析測定方法

為了評價養(yǎng)護效果，選擇確定了超聲波聯(lián)用技術(shù)養(yǎng)護當歸后藥效成分的分析測定方法.

3.2.1 高效液相色譜法分析測定阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞和丁基苯酞

高效液相色譜法(HPLC)，以液體為流動相，采用高壓輸液泵將具有不同極性的流動相(單一或混合溶劑、緩沖液等)泵入充有固定相(填充劑)的色譜柱，注入供試品，由流動相帶入色譜柱，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器檢測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號，實現(xiàn)試樣的分析.該法具有分離效能高、選擇性好、分析速度快、載液流速快、檢測靈敏度高、自動化程度高、流動相選擇范圍寬和應(yīng)用范圍廣等特點.可分析超過80%的有機物，特別是對高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物分離分析更顯優(yōu)勢.同時，不破壞樣品，易回收，色譜柱可反復(fù)使用.

3.2.1.1 阿魏酸的分析測定.HPLC法測定阿魏酸含量具有應(yīng)用較廣、方法簡單、可靠且專屬性好的獨特優(yōu)點，一般使用C18柱色譜柱，甲醇和水流動相，冰醋酸pH調(diào)節(jié)劑.何元等[44]建立了不同產(chǎn)地當歸藥材HPLC指紋圖譜，并測定了藥材及其提取物中阿魏酸等2種主成分的含量.建立的HPLC指紋圖譜結(jié)合含量測定，聚類分析(CA)和主成分分析(PCA)方法可全面客觀有效地進行當歸藥材質(zhì)量評價，為當歸配方顆粒的制備提供參考依據(jù).羅錚等[45]建立當歸中阿魏酸等5種活性成分的HPLC測定方法.方法的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性等方法學考察結(jié)果均符合指導原則要求.楊蕊菁等[46]采用HPLC法同時測定當歸中的阿魏酸及其他9種成分的含量以評價不同產(chǎn)地樣品的質(zhì)量.結(jié)果HPLC法結(jié)合主成分分析法可綜合評價當歸藥材的質(zhì)量，方法準確簡便，重現(xiàn)性好，并為當歸藥材的質(zhì)量評價提供依據(jù).馬紀偉等[47]的研究表明采用HPLC測定養(yǎng)血當歸軟膠囊中阿魏酸的含量，方法簡便，樣品處理方便易行，可作為養(yǎng)血當歸膠囊的質(zhì)量控制方法.劉雪楓等[48]采用HPLC法測定當歸芍藥散不同極性部位中阿魏酸和芍藥苷的含量，實驗結(jié)果表明該方法簡便、準確、分離效果好.

3.2.1.2 藁本內(nèi)酯的分析測定.藁本內(nèi)酯是當歸揮發(fā)油主要組分和重要活性和有效成分，也是公認鑒定當歸真?zhèn)魏驮u定其質(zhì)量的特征指標[49].藁本內(nèi)酯易氧化分解而難于保存[50]，進而影響以其為主要有效成分的中藥材質(zhì)量.其測定方法主要有HPLC法、氣相色譜法和雙波長薄層掃描法，但HPLC法使用更廣.王祝舉等[51]建立了HPLC法測定當歸中藁本內(nèi)酯含量的方法，方法學考察表明，該法準確、靈敏、簡單、快速，可作為當歸藥材及飲片質(zhì)量控制的方法之一.趙奎君[52]采用HPLC法和比色法，測定甘肅、云南、四川、陜西等地產(chǎn)當歸中阿魏酸、藁本內(nèi)酯和總多糖的含量.表明甘肅當歸其道地性具有科學依據(jù).吳姣等[53]建立了當歸膠囊的有效成分藁本內(nèi)酯和阿魏酸含量的HLPC法測定方法.該方法準確可靠，可用于當歸膠囊中有效成分含量測定.凌鋼等[54]采用HPLC法測定不同廠家當歸流浸膏中阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果表明不同廠家的當歸流浸膏中兩種成分的含量差異較大，同一廠家不同批次的當歸流浸膏中兩種成分含量也存在差異，故需盡快完善當歸流浸膏的質(zhì)量標準.陳方等[55]構(gòu)建了13批產(chǎn)地不同當歸藁本內(nèi)酯含量的HPLC指紋圖譜并進行方法學考察，優(yōu)化其測定方法并建立了HPLC指紋圖譜評價方法，測定方法簡便、可靠、穩(wěn)定、可行.潘娉娉等[56]建立同時測定補腎活血藥對杜仲-當歸阿魏酸、藁本內(nèi)酯等5種成分的含量的HPLC法.研究結(jié)果表明該方法準確穩(wěn)定，重復(fù)性好，可用于杜仲-當歸藥對的質(zhì)量控制.葉曉婭等[57]采用HPLC法同時測定當歸片中阿魏酸、藁本內(nèi)酯等的含量.經(jīng)方法學考察方法均符合有關(guān)規(guī)定，可用于當歸片的質(zhì)量控制.馬云桐等[58]建立HPLC法同步測定川芎、當歸SFE-CO2萃取物中藁本內(nèi)酯等7種成分含量的方法，并考察其中阿魏酸松柏酯的穩(wěn)定性.方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率均良好，乙腈溶液中萃取物中阿魏酸松柏酯穩(wěn)定性均最佳.馬丹等[59]采用HPLC法測定當歸滴丸中藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)論該方法準確、簡便可行、精密度高、重復(fù)性良好，可作為當歸滴丸中藁本內(nèi)酯的定量測定方法.

3.2.1.3 丁烯基苯酞的分析測定.丁烯基苯酞是當歸揮發(fā)油的另一主要成分，其含量在當歸揮發(fā)油中僅次于藁本內(nèi)酯[60]，是當歸活血調(diào)經(jīng)的藥效成分[61-62].謝京晶等[63]采用HPLC法同時測定當歸中丁烯基苯酞等6種成分含量的方法，結(jié)果表明方法準確、簡便、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，有利于提高當歸藥材的質(zhì)量控制.肖宇奇等[64]采用HPLC法對當歸樣品中的化學成分進行分離分析，分析不同生長期當歸中化學成分丁烯基苯酞等的動態(tài)變化.楊帆[65]以HPLC-MS/MS聯(lián)用的方法定性研究當歸中主要化學成分，由液相獲得了苯酞類化合物的豐富的結(jié)構(gòu)信息，為當歸藥材的質(zhì)量控制提供更多科學依據(jù).李冬華等[66]以高效液相色譜法測定當歸飲片中阿魏酸、藁本內(nèi)酯和正丁烯基苯酞的含量，用以建立和完善當歸飲片質(zhì)量標準.

3.2.1.4 丁基苯酞的分析測定.丁基苯酞(3-正丁基苯酞)是當歸又一重要的藥效成分，其測定主要以HPLC法.王寧寧等[67]以HPLC法研究3-正丁基苯酞在大鼠體內(nèi)的組織分布情況.丁軍霞等[68]建立了HPLC法同時測定當歸中正丁基苯酞等5種成分及不確定度評定方法，結(jié)果表明不確定度評定可為當歸有效成分的定量研究提供一定參考.鐘應(yīng)淮等[69]采用HPLC法同時測定茶芎苯酞類有效部位中正丁基苯酞等5種成分的含有量，結(jié)果表明方法穩(wěn)定可靠，可用于茶芎苯酞類有效部位的質(zhì)量控制.趙春順等[70]采用反相高效液相色譜法測定3-正丁基苯酞脂質(zhì)體的含量及有關(guān)物質(zhì)檢查，結(jié)果表明方法操作簡便、快速、準確、專屬性強，適用于3-正丁基苯酞的含量測定及其有關(guān)物質(zhì)檢查.崔升淼等[71]以HPLC法測定3-正丁基苯酞的量，研究藥物質(zhì)量濃度和羥丙基-β-環(huán)糊精(HPCD)用量對3-正丁基苯酞吸收的影響.余昕等[72]采用HPLC法測定不同干燥方法干燥的蘼蕪中丁基苯酞的含量，結(jié)果表明蘼蕪的干燥方法宜選用曬后烘干法.郭小藤等[73]采用HPLC法同時測定川芎油中藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和丁基苯酞含量，結(jié)果表明，該法相對方便經(jīng)濟.姚宗玲等[74]建立同時測定川芎中川芎嗪、阿魏酸、丁基苯酞、藁本內(nèi)酯和丁烯基苯酞5種有效成分含量的RP-HPLC方法.方法簡便快捷，重復(fù)性好，回收率高，可用于川芎中5種有效成分的同時測定，適用于川芎藥材及其制劑的質(zhì)量控制.趙曉莉等[75]采用HPLC法測定絡(luò)通膠囊中丁基苯酞的含量.方法簡便準確，重復(fù)性好，可用于絡(luò)通膠囊中丁基苯酞的含量測定.

3.2.2 紫外可見光譜法測定當歸多糖

紫外可見光譜法(UV-Vis)利用物質(zhì)分子吸收紫外、可見光光譜區(qū)(10～760nm)輻射進行分析測定，涉及原子和分子的價電子能級間的躍遷，廣泛用于測定有機和無機物.具有靈敏度、準確度和選擇性都較高等特點，操作快速簡便.

當歸多糖成分復(fù)雜，目前含量測定多采用UV-Vis法.張素斌等[76]采用苯酚-硫酸UV-Vis法測定當歸多糖含量對4種當歸多糖提取方法的比較研究.吳平安等[77]采用苯酚-硫酸UV-Vis法，以無水葡萄糖為對照品，在波長487 nm處測定當歸中的多糖含量.劉云[78]醇提當歸多糖并以采用苯酚-硫酸UV-Vis法測定當歸多糖含量，研究表明，當歸多糖含量較高，可進一步開發(fā)利用.何先元等[79]以超聲提取當歸多糖，以苯酚-硫酸UV-Vis法測定其含量，結(jié)果是超聲提取-分光光度法可以快速準確測定當歸多糖含量.許會生[80]探索了當歸多糖等的提取工藝，建立了多糖含量測定的苯酚-硫酸UV-Vis法，其研究和測定方法規(guī)范可靠.

4 結(jié)束語

綜上所述，當歸臨床應(yīng)用廣泛，但因貯藏養(yǎng)護技術(shù)方法欠科學，霉爛和蟲蛀等各種變質(zhì)變異現(xiàn)象嚴重，科學貯藏養(yǎng)護勢在必行.超聲波洗滌中藥材快速，環(huán)保，節(jié)能，節(jié)水，能夠抑制蟲卵、殺死害蟲、強烈殺滅細菌、霉菌、病菌等，藥效成分散失少，且有效保護中藥材的作用.天然抑菌，防腐性環(huán)境友好高分子在果蔬保鮮中的應(yīng)用廣泛，O3滅菌殺蟲效果明顯，在儲糧保鮮中應(yīng)用廣泛.UV-C能提高果蔬抗病性，減少采后腐爛；減少化學保鮮劑的使用，是綠色環(huán)保的貯藏保鮮途徑.選定超聲波聯(lián)用技術(shù)養(yǎng)護當歸后評價養(yǎng)護效果的待檢藥效成分為阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯肽、丁基苯肽和當歸多糖，選定各成分測定方法分別為HPLC法測定阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯肽和丁基苯肽，UV-Vis法測定當歸多糖.各待檢成分代表性強，測定方法得當，操作簡便，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性高，可靠性強，實際應(yīng)用廣泛.將無殘毒、無公害、安全綠色的超聲技術(shù)、超聲-O3、超聲-UV、超聲-O3-UV等技術(shù)聯(lián)用，應(yīng)用于當歸藥材貯藏養(yǎng)護中，可以提前消除隱患和并保證貯藏期間的防霉防蛀等變質(zhì)變異現(xiàn)象，具有廣闊的研究和應(yīng)用前景，必將為中藥材的科學養(yǎng)護與管理提供有力的理論支持和實踐指導，為中醫(yī)藥的發(fā)展，為藥材主產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展做出應(yīng)有的貢獻.