安運(yùn)佳 王強(qiáng) 錢(qián)憶家 薛紅 李若照 婁金波 劉運(yùn)權(quán)

摘要：目的 探討平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平對(duì)難治性癲癇模型大鼠海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）、P糖蛋白（P-gp）表達(dá)的影響。方法 選擇Wistar大鼠，采用顱內(nèi)注射海人酸建立難治性癲癇大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、卡馬西平組（0.03 g/kg），平肝止癇復(fù)方組（4.80 g/kg），高、中、低劑量平肝止癇復(fù)方+卡馬西平組（9.60+0.03 g/kg，4.80+0.03 g/kg，2.40+0.03 g/kg）。假手術(shù)組、模型組采用等體積蒸餾水灌胃，各組連續(xù)給藥4周，RT-PCR檢測(cè)海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1、P-gp mRNA 的表達(dá);Western Blot檢測(cè)（WB檢測(cè)）海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1、P-gp蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)的MRP1、P-gp mRNA含量及蛋白的表達(dá)均明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平用藥均能顯著降低海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1、P-gp mRNA含量及蛋白的表達(dá)（P<0.01，P<0.05）;與卡馬西平組比較，平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平用藥較好，其作用效果與給藥劑量高低呈正相關(guān)。結(jié)論 平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平能夠顯著降低難治性癲癇大鼠MRP1、P-gp表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)和降低海馬區(qū)MRP1、P-gp蛋白的表達(dá)可能是平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平抗耐藥性癲癇作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：平肝止癇復(fù)方;卡馬西平;難治性癲癇大鼠;耐藥性蛋白

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2021）04-0067-06

Effect of Pinggan Zhixian Compound Combined with Carbamazepine on the Expression of MRP1 and P-gp in Hippocampus and Temporal Lobe Cortex of Refractory Epilepsy Rats

AN Yun-jia1， WANG Qiang1， QIAN Yi-jia1， XUE Hong2， LI Ruo-zhao2， LOU Jin-bo2， LIU Yunquan1， 2

（1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550003， China， 2. The Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China）

【Abstract】Objective： To Study the effect of Pinggan Zhixian Compound combined with carbamazepine on the expression of multi-drug resistance related protein 1 （MRP1） and P-glycoprotein （P-gp） in the hippocampus and temporal lobe cortex of refractory epilepsy model rats. Methods： Wistar rats were selected and intracranial injection of kainic acid was used to establish a refractory epilepsy rat model. The rats were randomly divided into sham operation group， model group， carbamazepine group （0.03 g/kg）， and Pinggan Zhixian Compound group （4.80 g/kg）， high， medium， and low-dose Pinggan Zhi-epilepsy compound+carbamazepine group （9.60+0.03 g/kg， 4.80+0.03 g/kg， 2.40+0.03 g/kg）. The sham operation group and the model group were given intragastric administration with equal volume of distilled water. Each group was given continuous administration for 4 weeks. RT-PCR was used to detect the expression of MRP1 and P-gp mRNA in the hippocampus and temporal lobe cortex and Western Blot used to detect the hippocampus and temporal Expression of MRP1 and P-gp protein in temporal cortex. Results： Compared with those of the sham operation group， the MRP1， P-gp mRNA content and protein expression in the hippocampus and temporal lobe cortex of the model group were significantly increased （P<0.01）. Compared with those of the model group， the Pinggan Zhixian Compound combined with carbamazepine group could significantly reduce the MRP1， P-gp mRNA content and protein expression in the hippocampus and temporal lobe cortex areas （P<0.01， P<0.05）. Compared with the carbamazepine group， the Pinggan Zhixian Compound combined with carbamazepine group had a better drug effect， and its effect was positively correlated with the level of administration dose. Conclusion： Pinggan Zhixian Compound combined with carbamazepine can significantly reduce the expression levels of MRP1 and P-gp in refractory epilepsy rats. Reversing and reducing the expression of MRP1 and P-gp protein in hippocampus may be one of the mechanisms of anti-drug-resistant epilepsy of the combination of Pinggan Zhixian Compound and carbamazepine.

【Key words】Pinggan Zhixian Compound;carbamazepine;refractory epilepsy rats;drug resistance protein

癲癇是以腦神經(jīng)元異常放電引起反復(fù)癇性發(fā)作為特征的一種慢性腦部疾病，全球癲癇患者高達(dá)6500萬(wàn)人，少部分患者進(jìn)展成難治性癲癇[1-2]。臨床上大約有三分之一的患者對(duì)抗癲癇藥物（antiepileptic drug，AED）不敏感而使得癲癇發(fā)作不能得到有效控制，反復(fù)的癲癇發(fā)作導(dǎo)致神經(jīng)元的壞死與凋亡、突觸重塑，從而成為難治性癲癇（intractable epilepsy，IE）[3-5]。目前，闡明難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制，預(yù)防和降低癲癇發(fā)作一直是癲癇研究的熱點(diǎn)。

卡馬西平作為癲癇的經(jīng)典治療藥物，廣泛的運(yùn)用于臨床及基礎(chǔ)研究，課題組前期研究表明，平肝止癇復(fù)方對(duì)難治性大鼠具有顯著的治療效果[6-7]。在此基礎(chǔ)上本次研究將探討平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平及單用卡馬西平對(duì)難治性癲癇大鼠的治療效果，觀察中藥復(fù)方是否顯著增強(qiáng)療效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)顱內(nèi)注射海人酸建立難治性癲癇動(dòng)物模型，探討平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平對(duì)難治性癲癇模型大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1、P-gp表達(dá)的影響。為進(jìn)一步從耐藥性蛋白表達(dá)的角度探討其作用機(jī)制奠定了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 平肝止癇復(fù)方藥物組成：天麻、石菖蒲、全蝎、郁金、膽南星，均購(gòu)于貴陽(yáng)中醫(yī)二附院中藥免煎顆粒沖劑配方，來(lái)自四川省綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司。天麻，產(chǎn)品批號(hào)：1008072，每袋1.5 g，相當(dāng)于飲片3 g;石菖蒲，產(chǎn)品批號(hào)：1009044，每袋1.1 g，相當(dāng)于飲片6 g;全蝎，產(chǎn)品批號(hào)：1108023，每袋0.6 g，相當(dāng)于飲片3 g;郁金，產(chǎn)品批號(hào)：1009018，每袋1.5 g，相當(dāng)于飲片3 g;膽南星，產(chǎn)品批號(hào)：1002036，每袋1.5 g，相當(dāng)于飲片3 g;丙戊酸鈉片（湖南湘中制藥有限公司，批號(hào)：120402）;海人酸（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：K0250），卡馬西平（江蘇恩華藥業(yè)，生產(chǎn)批號(hào)：H321502）;兔單抗 GAPDH（杭州賢至生物有限公司，批號(hào)：AB-P-R 001）、兔單抗 MRP1（Invitrogen，批號(hào)：PA5-78694）、兔單抗P-gp（Abcam，批號(hào)：Ab170904）。

1.2 動(dòng)物 健康Wistar大鼠100只，雄性。體重230～270 g，從長(zhǎng)沙市天勤技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)，飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。術(shù)前每組均以大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)至體重（250±20 g）后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，室溫18～22℃，濕度為60%～70%。

1.3 試劑 BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C1090、P0011，上海碧云天生物公司）;TAKARA熒光定量試劑盒（批號(hào)：RR036Q、RR820A，寶生物工程（大連）有限公司）;蛋白Marker（批號(hào)：DM131-02，北京全式金生物技術(shù)有限公司）;TRIzol試劑（批號(hào)：Lot：252250AX，北京艾德萊生物科技有限公司）;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，兔單抗P-gp、兔多抗MRP1（批號(hào)：ab170904、pa5-78694，Abcam）。

1.4 儀器 水平電泳儀、紫外分析儀（型號(hào)：JY300、JY02S，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）;電轉(zhuǎn)儀、垂直電泳槽（型號(hào)：DYCZ-40、DYCZ-24DN，北京六一儀器廠）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)：QuantStudio 6，ABI）;PCR儀（型號(hào)：EDC-810，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）;離心機(jī)（型號(hào)：HI650，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）;分光光度計(jì)（型號(hào)：752，舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司（上海））;超級(jí)純水儀（型號(hào)：AJY-0501，Aquapro）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號(hào)：DHG 9203A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)：HW-SY11-K P2，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司）;酶標(biāo)儀（Thermo，型號(hào)：mμlISKANMK3）;移液器（規(guī)格：0.5 μL，10 μL，100 μL，1000 μL，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司）。

1.5 方法

1.5.1 分組及給藥 將100只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行造模，采用Racine評(píng)分法進(jìn)行分級(jí)評(píng)分：I級(jí)，咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐;II級(jí)，以點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主的頸部肌肉抽搐;Ⅲ級(jí)，單側(cè)前肢陣攣、抽搐;Ⅳ級(jí)，雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起;V級(jí)，雙側(cè)后肢強(qiáng)直，身體背曲強(qiáng)直，跌倒伴全身陣攣。造模后出現(xiàn)Ⅳ級(jí)以上發(fā)視為癲癇造模成功，未達(dá)到Ⅳ級(jí)發(fā)作的歸入造模不成功組棄用。最終有48只大鼠造模成功，成功率為48%。將制備成功的難治性癲癇模型大鼠隨機(jī)分為：①模型組，②卡馬西平組，③平肝止癇復(fù)方組，④平肝止癇復(fù)方（高劑量）+卡馬西平組，⑤平肝止癇復(fù)方（中劑量）+卡馬西平組，⑥平肝止癇復(fù)方（低劑量）+卡馬西平組，每組8只，另設(shè)假手術(shù)組8只。模型組與假手術(shù)組常規(guī)飼養(yǎng)，給予生理鹽水2 mL/d灌胃，每天早上9點(diǎn)給藥，剩余各組每天一次給予藥物干預(yù)。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)人與大鼠用藥劑量換算方法進(jìn)行轉(zhuǎn)換：卡馬西平用量為0.03 g/（kg·d），每天1次;平肝止癇復(fù)方組用量分別取免煎顆粒各成分的中劑量相加為4.80 g/（kg·d），以此類推平肝止癇復(fù)方組高、中、低劑量為9.60 g/（kg·d），4.80 g/（kg·d），2.40 g/（kg·d）;平肝止癇復(fù)方（高、中、低劑量）+卡馬西平組用量為：9.60+0.03 g/（kg·d），4.80+0.03 g/（kg·d），2.40+0.03 g/（kg·d），每天1次。各組大鼠統(tǒng)一灌胃給藥，連續(xù)灌胃給藥4周后分別取材。

1.5.2 難治性癲癇大鼠模型制備 10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射Wistar大鼠，麻醉后，將其頭部置于顱腦立體定位儀上，剃毛備皮，75%酒精消毒，沿矢狀線剪開(kāi)約2 cm皮膚，暴露顱骨，在頭部背側(cè)中部作縱行切口，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織，鈍性分離骨筋膜拉鉤暴露手術(shù)視野，按大鼠腦立體定位圖譜，選擇右側(cè)海馬腹后部CA3區(qū)的三維坐標(biāo)：X=-5.3 mm，Y=4.0 mm，Z=-6.0 mm，即注藥點(diǎn)，調(diào)整X軸和Y軸的坐標(biāo)確定H點(diǎn)（X=-5.3 mm，Y=4.0 mm，Z=0.0 mm）并在H點(diǎn)顱骨鉆孔，在微量注射內(nèi)抽入1 μg/μL的海人酸2 μL，向下進(jìn)針-6.0 mm達(dá)CA3中心點(diǎn)，在10 min內(nèi)緩慢勻速地注射完畢，留置5～>10 min后緩慢拔出注射器后鐘表螺絲封口，在對(duì)應(yīng)左側(cè)上鐘表螺絲，用牙科水泥封口，將電極接在鐘表螺絲上面，縫合頭皮。假手術(shù)組在同樣解剖定位下予2 μL生理鹽水。

1.5.3 難治性癲癇大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)合近年來(lái)的相關(guān)文獻(xiàn)研究，海人酸癲癇大鼠模型的成功標(biāo)準(zhǔn)判定為：海人酸海馬區(qū)注射后，觀察大鼠癲癇發(fā)作情況，若4h內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)3次IV-V級(jí)發(fā)作，同時(shí)在慢性期內(nèi)觀察出現(xiàn)自發(fā)性癇性發(fā)作的大鼠作為制作成功的難治性癲癇大鼠模型[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合以上判斷標(biāo)準(zhǔn)及前期課題組研究情況進(jìn)一步完善后制定難治性癲癇模型成功標(biāo)準(zhǔn)為：（1）KA海馬CA3區(qū)注射后Racine分級(jí)出現(xiàn)IV級(jí)以上癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)間（>30min）。（2）在經(jīng)過(guò)苯妥英鈉藥物篩選后的慢性自發(fā)發(fā)作期內(nèi)出現(xiàn)自發(fā)性癇性發(fā)作超過(guò)3次Racine分級(jí)達(dá)III級(jí)以上發(fā)作。（3）腦電圖監(jiān)測(cè)顯示有明顯癲癇波3次以上者，作為難治性癲癇成功的標(biāo)志。（4）慢性自發(fā)發(fā)作期內(nèi)無(wú)癇性自發(fā)發(fā)作的及腦電圖記錄過(guò)程未出現(xiàn)明顯癲癇波的大鼠予棄用。

1.5.4 腦組織標(biāo)本制作 將Wistar大鼠快速處死，置于冰盤(pán)上，開(kāi)顱迅速取出腦組織，將大鼠腦干及小腦切除，小心沿矢狀面切開(kāi)腦半球，剝離注射側(cè)，將海馬與顳葉皮質(zhì)區(qū)分別裝入EP管中，做好標(biāo)記，采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，并放入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。腦組織標(biāo)本常規(guī)脫水及石蠟包埋操作，相關(guān)染色步驟按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)記錄進(jìn)行染色操作。

1.5.5 QPCR法檢測(cè)大鼠海馬組織及海馬神經(jīng)元細(xì)胞中MRP1、P-gp的mRNA表達(dá) 設(shè)計(jì)并合成大鼠MRP1、P-gp及GAPDH基因的QPCR 檢測(cè)引物（表1）。首先嚴(yán)格按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，分別取海馬組織提取總RNA。其次，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作要求，把RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。QPCR的總反應(yīng)體系為20 μL，其中包含了實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液10 μL，左、右引物各0.8 μL，超純水7.4 μL以及模板1.0 μL。 然后QPCR分三步進(jìn)行：30 s 95℃預(yù)變性，5 s 95℃變性，20 s 60℃退火及20 s 72℃延伸，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品均檢測(cè)3次。最后采用2-Ct法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)情況。

1.5.6 WB檢測(cè)大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1、P-gp的變化 取出凍存的海馬及顳葉皮質(zhì)組織，加入蛋白裂解溶液600 μL，于冰上裂解15 min，于4 °C下離心10 min，轉(zhuǎn)速為12000 r/min，收集上清液。于4°C下經(jīng)一抗MRP1、P-gp、內(nèi)參GAPDH等過(guò)夜靜置孵育，在37°C條件下，通過(guò)標(biāo)記二抗辣根過(guò)氧化酶搖床孵育2 h后，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)顯影后掃描膠片，將成像所得圖片Image J圖像分析軟件灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)目的蛋白、內(nèi)參蛋白條帶光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，目的蛋白的表達(dá)量以兩者光密度比值（目的蛋白/內(nèi)參蛋白）表示。

1.5.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入EXCEL建立數(shù)據(jù)庫(kù)，使用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來(lái)表達(dá)，滿足正態(tài)分布與差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，多組間比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA），2組間比較用LSD-t檢驗(yàn)，對(duì)不滿足方差齊性者采用Kruskal-Wallis（K-W）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MRP1、P-gp及GAPDH mRNA的RT PCR表達(dá)結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)中MRP1及P-gp mRNA表達(dá)情況如表2、圖1所示。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1及P-gp 表達(dá)均有顯著性增加（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1表達(dá)均有顯著性降低（P<0.01），除單純中藥復(fù)方組以外，卡馬西平組、不同劑量平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)P-gp表達(dá)均顯著性降低（P<0.05），表明藥物干預(yù)后，能逆轉(zhuǎn)下調(diào)在海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1及P-gp 表達(dá)水平;與卡馬西平組比較，不同劑量平肝止癇復(fù)方+卡馬西平組能顯著降低MRP1的表達(dá)（P<0.05），但P-gp的表達(dá)無(wú)明顯差異。見(jiàn)表2、圖1。

2.2 腦組織MRP1及P-gp Western Blot檢測(cè) 大鼠海馬及顳葉皮質(zhì)區(qū)的MRP1及P-gp蛋白表達(dá)見(jiàn)圖4，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中MRP1及P-gp蛋白表達(dá)極顯著增強(qiáng)（P<0.01），與模型組比較，平肝止癇復(fù)方低、中、高劑量聯(lián)合卡馬西平組大鼠腦組織MRP1及P-gP蛋白表達(dá)顯著減?。≒<0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討論

癲癇是一種病因十分復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，癲癇發(fā)作是大腦異常過(guò)度神經(jīng)元放電的結(jié)果，近年來(lái)，癲癇的耐藥機(jī)制成為研究的重點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，多藥耐藥相關(guān)蛋白，如MRP1、P-gp等表達(dá)上調(diào)與難治性癲癇耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[9-10]，故通過(guò)本試驗(yàn)的研究，為進(jìn)一步從多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)探討其作用機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。近年來(lái)，難治性癲癇的耐藥機(jī)制成為研究的突破，研究發(fā)現(xiàn)，耐藥性蛋白MRP1、P-gp等表達(dá)上調(diào)與難治性癲癇耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[10-11]。P-gp和MRP1是兩種具有“藥物泵”功能的蛋白，兩者均能主動(dòng)把疏水化合物和藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。目前發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗癲癇藥物具有很好的脂溶性，能夠通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散透過(guò)血腦屏障，MRP1和P-gp是它們的底物，但若腦內(nèi)多藥耐藥蛋白表達(dá)增高，抗癲癇藥物在透過(guò)血腦屏障（BBB）時(shí)可被P-gp和MRP1等泵回血中，限制脂溶性藥物進(jìn)入腦內(nèi)，使抗癲癇藥物濃度降低[12]。難治性癲癇患者中，因?yàn)镻-gp和MRP1等蛋白在腦組織的過(guò)量表達(dá)，參與了多種抗癲癇藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低了腦組織內(nèi)的血藥濃度，導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作，成為難治性癲癇患者。

癲癇的治療原則是基于該病的發(fā)病方式及不同的癥狀體征來(lái)選擇藥物治療。臨床顳葉癲癇發(fā)作類型類似于在海馬區(qū)局部注射海人酸引起的SE后慢性特發(fā)性癲癇模型，表現(xiàn)為癲癇綜合征和復(fù)雜部分性癲癇發(fā)作?？R西平是復(fù)雜部分性癲癇發(fā)作在臨床用藥中的首選，故本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照藥物選用卡馬西平?？R西平系廣譜抗癲癇藥物，主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別適用于癲癇復(fù)雜部分性發(fā)作、亦稱精神運(yùn)動(dòng)性發(fā)作或顳葉癲癇，對(duì)大發(fā)作、局限性發(fā)作、和混合型癲癇也有效。實(shí)驗(yàn)藥理發(fā)現(xiàn)卡馬西平無(wú)論是對(duì)全身性的癲癇模型還是對(duì)部分性的癲癇模型都具有良好的抗驚厥效果?？R西平的主要作用機(jī)制可能與降低神經(jīng)細(xì)胞膜對(duì)Ca2+和Na+的滲透性，以此減輕細(xì)胞的興奮性，延長(zhǎng)神經(jīng)細(xì)胞的不應(yīng)期有關(guān)。同時(shí)也與增加γ-氨基丁酸的濃度，促進(jìn)GABA突觸之間的傳遞功能有關(guān)?？R西平在臨床應(yīng)用中有諸多不良反應(yīng)，如肝功能損害、皮疹、造血功能受損、共濟(jì)失調(diào)等，嚴(yán)重的副作用是剝脫性皮炎。本實(shí)驗(yàn)研究中觀察到卡馬西平治療的大鼠未發(fā)現(xiàn)明顯皮疹及共濟(jì)失調(diào)，但本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)肝功能及造血系統(tǒng)的變化。

癲癇屬于中醫(yī)癇證的范疇，早在兩千多年前，中醫(yī)就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到癲癇與肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)密切相關(guān)，如《素問(wèn)·風(fēng)論篇》：“風(fēng)者，善行而數(shù)變”。另有“善行者，無(wú)處不到，數(shù)變者，證不一端。風(fēng)之為邪氣，其厲矣哉”、“風(fēng)通氣于肝，肝主筋，故風(fēng)傷筋”的理論。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為癲癇是一種發(fā)作性的神志異常性疾病，其病機(jī)為肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，風(fēng)痰上擾，心神被蒙;肝火素旺，火動(dòng)生風(fēng)，煎熬津液，結(jié)而為痰，風(fēng)動(dòng)痰升，阻塞心竅。主要病理乃風(fēng)、痰、氣、火、瘀，膠結(jié)不解，其病變臟腑雖為心、肝、脾、腎，但總離不開(kāi)肝主疏泄、藏血功能失常;心主藏神，肝血充盈，則心有所藏，肝血不足，則心脈不充而神志失常;脾主運(yùn)化，氣機(jī)不暢，脾運(yùn)失職，則痰濁內(nèi)生，蔽竅致癇;腎主藏精生髓，髓充于腦，精血同源，肝血不足，髓元不充則腦?？仗?、神志失常。而肝臟升發(fā)太過(guò)和不及，肝腎陰虧而陽(yáng)生無(wú)制，陰血不足，虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)都可致癇證發(fā)生，因而平肝止癇是癇證中醫(yī)治療的關(guān)鍵。

平肝止癇復(fù)方是長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而得，其以天麻為君藥，全蝎、膽南星、郁金為臣藥，石菖蒲、冰片為佐使藥的復(fù)方藥。天麻熄風(fēng)止痙、平肝潛陽(yáng)、祛風(fēng)通絡(luò);全蝎祛風(fēng)止痙;郁金行氣化瘀、清心解郁;膽南星清熱化痰，熄風(fēng)定驚;石菖蒲開(kāi)竅化濁、鎮(zhèn)驚定癇。諸藥合用，達(dá)到清散肝熱、祛風(fēng)止痙、開(kāi)竅化痰、鎮(zhèn)驚定癇功效。

根據(jù)研究結(jié)果，成功造模后的難治性癲癇大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1、P-gp mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯增加，通過(guò)卡馬西平、平肝止癇復(fù)方及平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平用藥干預(yù)處理后。結(jié)果，以MRP1、P-gp為目標(biāo)蛋白，與模型組比較，各給藥組大鼠海馬區(qū)灰度比值及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與顳葉皮質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均降低（P<0.01，P<0.05），而單用平肝止癇復(fù)方對(duì)海馬區(qū)灰度比值無(wú)影響;PCR顯示MRP1及P-gp mRNA表達(dá)均顯著下調(diào);WB檢測(cè)MRP1及P-gp蛋白均顯著減少，這些表明藥物干預(yù)后，聯(lián)合用藥能逆轉(zhuǎn)下調(diào)在海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1及P-gp表達(dá)水平;與卡馬西平組比較，不同劑量平肝止癇復(fù)方+卡馬西平組能顯著降低海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（P<0.01，P<0.05），PCR顯示MRP1 mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)，P-gp mRNA 表達(dá)均有下調(diào)，但差異無(wú)顯著性;WB檢測(cè)MRP1及P-gp蛋白均顯著減少，結(jié)合聯(lián)合用藥不同劑量組均值對(duì)比分析，表明隨著劑量變化，作用結(jié)果與給藥劑量高低呈正相關(guān)，下調(diào)趨勢(shì)較單用卡馬西平要好。

4 小結(jié)

難治性癲癇會(huì)產(chǎn)生不同程度的耐藥性，逆轉(zhuǎn)和下調(diào)相關(guān)耐藥蛋白的異常表達(dá)，提高抗癲癇藥物在腦組織中的濃度，可為耐藥性癲癇的治療提供新的途徑和思路，通過(guò)本試驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平治療難治性癲癇大鼠，中西藥合用，可進(jìn)一步提高藥物透過(guò)血腦屏障，提高腦組織中血藥濃度，對(duì)大鼠海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1、P-gp的作用效果與給藥劑量的高低呈正相關(guān)，下調(diào)趨勢(shì)較單用平肝止癇復(fù)方或卡馬西平要好，故抑制海馬區(qū)及顳葉皮質(zhì)區(qū)MRP1、P-gp的異常表達(dá)，可能是平肝止癇復(fù)方聯(lián)合卡馬西平抗耐藥性癲癇的作用機(jī)制之一。

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（收稿日期：2020-11-23）