謝靜雯,于 靖,楊錫洪,2,*,解萬翠,2,3,4,*

(1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院,山東青島 266042; 2.山東省生物化學(xué)工程重點實驗室,山東青島 266042; 3.青島智科檢驗檢測有限公司,山東青島 266002; 4.青島信和源生物科技有限公司,山東青島 266002)

蝦醬是一種口感鮮香、營養(yǎng)豐富的海產(chǎn)發(fā)酵食品,具有刺激食欲的獨特香味,是我國東南沿海地區(qū)備受歡迎的調(diào)味品,而且在日本、韓國以及東南亞等一些國家的居民也經(jīng)常食用。蝦醬發(fā)酵過程中,涉及到糖類、蛋白質(zhì)等大分子降解,而傳統(tǒng)發(fā)酵存在周期長、品質(zhì)不穩(wěn)定和難以連續(xù)化生產(chǎn)等弊端,容易產(chǎn)生有害物質(zhì),如生物胺、揮發(fā)性鹽基氮等[1]。其中,組胺是生物胺中對人類健康影響最大的一類,其不僅會降低產(chǎn)品質(zhì)量,還會導(dǎo)致食品安全問題[2]。如何在保持蝦醬傳統(tǒng)風(fēng)味的同時,利用現(xiàn)代食品加工技術(shù)進(jìn)行改造,降低組胺等有害物質(zhì)生成,提升產(chǎn)品品質(zhì)及安全,是目前亟待解決的問題。多種添加劑已被證明可抑制組胺產(chǎn)生,并取得良好應(yīng)用,降組胺效果明顯[3]。

蔗糖在食品添加中具有多種功能,對食品的性狀、風(fēng)味和品質(zhì)有重要影響。Silva等[4]證明在發(fā)酵菌種的生長培養(yǎng)基中加入蔗糖,能提高菌種加熱、干燥及儲藏時的存活率。Liu等[5]研究葡萄酒發(fā)酵技術(shù),發(fā)現(xiàn)蔗糖的添加提高了酵母的生長速度和酒精的產(chǎn)量,改變了葡萄酒色澤,并在發(fā)酵過程中略微降低了可滴定的酸度。Mah等[6]發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵鳳尾魚中,蔗糖的添加對組胺的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。然而,有關(guān)添加蔗糖對蝦醬成分和感官的影響,以及相關(guān)發(fā)酵工藝的調(diào)整和精進(jìn),目前沒有進(jìn)一步的深入分析和研究。

本課題組前期對傳統(tǒng)蝦醬的微生物多樣性進(jìn)行了研究,分離和鑒定了季氏畢赤氏酵母(Pichiagilliermondii)[7]和黑曲霉(Aspergillusniger)[8]兩種發(fā)酵優(yōu)勢菌,并應(yīng)用于蝦醬的復(fù)合發(fā)酵,得到了酵母菌、霉菌及乳酸菌1∶3∶5的最佳混合濃度,提升蝦醬感官風(fēng)味,優(yōu)化制醬工藝[9]。在此基礎(chǔ)上,本論文選取了合適范圍的添加量,設(shè)置了梯度質(zhì)量的蔗糖進(jìn)行快速發(fā)酵實驗,旨在探究其對蝦頭醬制醬品質(zhì)及食品安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)蝦頭 湛江國聯(lián)水產(chǎn)開發(fā)股份有限公司;季氏畢赤氏酵母(Pichiagilliermondii)、黑曲霉(Aspergillusniger) 本實驗室從廣東傳統(tǒng)蝦醬中分離純化得到[10];植物乳桿菌(Lactobacillusplanticola)為標(biāo)準(zhǔn)菌株 中國工業(yè)微生物菌種保管中心;磷酸組胺(BR) 南京奧多福尼生物科技有限公司;MRS(LactobacilliMRS Broth)液體培養(yǎng)基、PDA(Potato Dextrose Agar)液體培養(yǎng)基、YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)液體培養(yǎng)基 杭州百思生物技術(shù)有限公司;其他試劑 均為分析純。

T18高速均質(zhì)機(jī) 德國IKA;SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、凈化工作臺、HPX-9052MBE型恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;PHS-3C酸度計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)合發(fā)酵劑活化 分別挑取純化后的季氏畢赤氏酵母、黑曲霉以及植物乳桿菌(1∶3∶5最佳復(fù)合比例)菌株,分別接種于YPD、PDA和MRS液體培養(yǎng)基,搖床上80 r/min培養(yǎng)24 h(28、37和37 ℃),移取1 mL菌懸液至平板培養(yǎng)基并涂布均勻,恒溫培養(yǎng)48 h(28、37和37 ℃)[11]。

1.2.2 快速發(fā)酵制醬工藝 工藝流程如圖1所示。蝦頭洗凈剪須,巴氏殺菌(75 ℃,30 min)后破碎打漿,放入發(fā)酵罐(200 g)中,按比例加入活化菌種、18%食鹽和不同梯度蔗糖,培養(yǎng)箱保溫(40 ℃,14 d),發(fā)酵期間每2 d進(jìn)行攪拌取樣,置于-20 ℃冰箱保藏待測[10]。

圖1 蝦頭醬快速發(fā)酵工藝流程Fig.1 The shrimp head sauce rapid fermentation process

1.2.3 蔗糖添加預(yù)實驗 設(shè)置1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的蔗糖梯度,加入到發(fā)酵池中,發(fā)酵后進(jìn)行組胺含量和感官的測定。

1.2.4 理化及營養(yǎng)成分分析 發(fā)酵過程pH分析:按照Techaratanakrai等[12]的方法修改。將20 g樣品充分溶解于純水,定容至200 mL,靜置20 min,均質(zhì)(3 min、6000 r/min),過濾后采用酸度計測定。

蛋白質(zhì)、粗脂肪、總糖及水分含量測定:分別按照GB 5009.5-2010、GB/T 14772-2008、GBT 9695.31-2008、GB 5009.3-2010執(zhí)行。

1.2.5 安全性指標(biāo)分析 組胺化合物:10%三氯乙酸取20 mL,與5 g蝦頭醬混合于三角燒瓶中,超聲(55 ℃ 20 min、60 W),中間振蕩2～3次,充分萃取、過濾,3次沖洗殘渣(10 mL蒸餾水),合并濾液后調(diào)pH至5.00±0.02(氫氧化鈉250 g/L),加水定容至100 mL,以波長450 nm為參比,采用比色快速法[13]測定。

氨基態(tài)氮、揮發(fā)性鹽基氮及菌落總數(shù)測定:分別按照GB/T 5009.39-2003、SC/T 3032-2007、GB 47892-2010進(jìn)行測定。

1.2.6 感官評定 邀請8名經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練后的食品專業(yè)研究生作為品評員,請品評員對產(chǎn)品進(jìn)行感官評定。對樣品的風(fēng)味特征進(jìn)行評分,評分標(biāo)準(zhǔn)見表1列出[10]。評分包括0～9分,總計10個分?jǐn)?shù),“0”表示沒感受到該風(fēng)味,“9”則表示此風(fēng)味濃郁,綜合得分=滋味均分×0.4+香氣均分×0.6[14]。

表1 蝦醬感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standards for sensory evaluation of shrimp paste

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗平均進(jìn)行3次以上(包括3次),結(jié)果以平均值為準(zhǔn)。數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016、Origin 9.1及SPSS 16.0進(jìn)行繪圖、處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖添加量篩選

為了選取合適的蔗糖添加劑量,進(jìn)行發(fā)酵實驗詳細(xì)研究,更有效地分析蔗糖對蝦醬快速發(fā)酵的質(zhì)量影響,以組胺含量和感官評分作為指標(biāo),來考量適宜的添加區(qū)間。

如圖2所示,在發(fā)酵產(chǎn)品中,隨著蔗糖的增加,組胺含量先下降后趨于平緩,添加量大于6%時下降趨勢變緩。同時,低含量的蔗糖使感官評分有略微的提升,但添加量過多則完全破壞蝦醬的發(fā)酵風(fēng)味。已有研究表明,糖含量低于8%利于非高糖酵母生長[15],且含糖量較高時,也會使乳酸菌產(chǎn)酸能力增加從而降低感官風(fēng)味。綜合考慮降低組胺、提升風(fēng)味、菌種高效發(fā)酵和經(jīng)濟(jì)等各方面指標(biāo),選取2%、4%和6%的蔗糖添加量進(jìn)行快速發(fā)酵實驗。

圖2 蔗糖添加量對組胺含量和感官評分的影響Fig.2 The effect of sucrose addition on histamine content and sensory score

2.2 蔗糖對理化及營養(yǎng)成分的影響

在菌種發(fā)酵過程中,pH是發(fā)酵時間和發(fā)酵產(chǎn)物生化、微生物特性的重要理化指標(biāo)[16]。pH不但對組胺的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用,還會引起發(fā)酵微生物的一系列活動及發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)[17]。Fan等[18]評估了南極磷蝦的發(fā)酵條件對蝦醬品質(zhì)的影響,研究表明pH約7～9時發(fā)酵過程較為穩(wěn)定,產(chǎn)品表現(xiàn)出最佳的品質(zhì)和性能。圖3中所示,發(fā)酵過程中,在第2 d蝦頭醬pH迅速降低,約8.4左右,之后緩慢上升逐漸趨于穩(wěn)定,約8.6左右。

圖3 蔗糖對發(fā)酵過程中pH的影響Fig.3 The effect of sucrose on pH during fermentation

發(fā)酵過程中,pH始終保持在8.3～8.8的范圍之內(nèi)。發(fā)酵初始階段,蝦頭在乳酸菌作用下產(chǎn)生酸性物質(zhì),出現(xiàn)pH降低的結(jié)果。期間,也存在糖酵解途徑產(chǎn)生丙酮酸,以及ATP酶解釋放能量和磷酸根,促使pH迅速下降[19],與此同時伴隨著發(fā)酵產(chǎn)品新鮮度的降低。而后,發(fā)酵體系中的酶和微生物等逐步降解含氮化合物,如蛋白質(zhì)、肽類和氨基酸等,引起堿性產(chǎn)物如三甲胺等不斷積累,從而使pH增加[20]。與空白對照組相比,蔗糖的添加未引起pH較大波動,說明對產(chǎn)品新鮮度的影響并不明顯。

發(fā)酵結(jié)束后,產(chǎn)品中的各類營養(yǎng)素測定結(jié)果見表2,發(fā)酵過程對最終產(chǎn)品的營養(yǎng)成分和含量有不同程度的影響。結(jié)果顯示,粗脂肪含量維持在1.27%～1.56%,添加蔗糖對粗脂肪含量沒有顯著(P<0.05)影響,添加量2%與6%時與對照組相近,添加4%的產(chǎn)品脂肪含量略低。蛋白質(zhì)含量維持在9.36～9.66 g/100 g,與對照組9.10 g/100 g相比有輕微上升,可能與發(fā)酵功能的微生物蛋白質(zhì)有關(guān),根據(jù)李娜等[21]的研究,蔗糖的添加對其蛋白的生物合成功能有所增加。2%蔗糖添加組的產(chǎn)品水分含量與對照組相近,而添加量4%與6%的產(chǎn)品水分則出現(xiàn)了顯著(P<0.05)降低,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,蔗糖水解為易代謝的碳水化合物,菌種生長代謝較旺盛[22],導(dǎo)致水分消耗增加。發(fā)酵蝦醬的總糖含量最高為0.519%,2%、4%、6%的蔗糖使蝦頭醬中總糖含量分別為對照組的2.94、3.79和4.67倍。蔗糖能夠水解成還原糖,作為發(fā)酵微生物的碳源底物被降解,Tabaszewska等[23]分析了乳酸菌發(fā)酵白蘆筍的各類營養(yǎng)素,發(fā)現(xiàn)總糖含量下降,表明發(fā)酵過程對碳素營養(yǎng)源的發(fā)酵消耗。除此之外,蔗糖的去向還與美拉德反應(yīng)有關(guān),可與氨基化合物生成風(fēng)味產(chǎn)物。

表2 蔗糖添加量對蝦醬成分的影響Table 2 Effect of sucrose addition on shrimp paste composition

2.3 蔗糖對安全性指標(biāo)的影響

組胺是發(fā)酵水產(chǎn)品品質(zhì)和安全的風(fēng)險因素和重要指標(biāo)。添加蔗糖對發(fā)酵期間組胺含量的影響,結(jié)果如圖4所示,蔗糖添加劑對組胺的產(chǎn)生有抑制效果,隨著蔗糖增加抑制效果上升。發(fā)酵0～2 d時,對照組中的組胺含量急劇上升,增加為初始的1.05倍,而后趨于穩(wěn)定。主要因為原生的產(chǎn)組胺微生物存在于蝦頭中,且發(fā)酵劑中的乳酸菌也具有一定產(chǎn)組胺能力,發(fā)酵時微生物代謝強(qiáng),發(fā)酵酶被激活,因此迅速產(chǎn)生大量組胺。除此之外,組胺的產(chǎn)生與游離氨基酸中的組氨酸關(guān)系密切[24]。蝦頭本身含有一定量的蛋白質(zhì)和氨基酸,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,微生物大量繁殖,同時產(chǎn)生活力旺盛的組氨酸脫羧酶,作用于游離的組氨酸,即生成大量組胺,作用機(jī)制如圖5所示[25]。

圖4 發(fā)酵過程中組胺、TVB-N和AA-N含量變化及發(fā)酵完成后的菌落總數(shù)Fig.4 The changes in histamine,TVB-N and AA-N contents during fermentation and the total number of colonies after fermentation

圖5 蔗糖對發(fā)酵中組胺的降解機(jī)制Fig.5 The sucrose degradation mechanism of histamine in fermentation

發(fā)酵0～2 d,組胺含量急速增加,蔗糖組含量明顯低于對照組。4 d后,對照組組胺含量緩慢上升趨于穩(wěn)定,蔗糖組則出現(xiàn)不同程度的下降。8～12 d,蔗糖組組胺含量下降明顯且隨蔗糖含量增加而逐級降低,組胺含量與蔗糖添加量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。發(fā)酵14 d時，2%、4%、6%蔗糖組的組胺含量分別為對照組的71.4%、60.0%和47.4%。

發(fā)酵初期,體系中的產(chǎn)組胺微生物活躍度高,此時組胺的形成,對最終產(chǎn)品中的組胺含量有決定性影響[26]。由于蔗糖的增加,發(fā)酵池中的滲透壓升高,不僅抑制微生物活性,也會抑制組氨酸的脫羧反應(yīng),切斷了組胺的生成路徑。除此之外,有些微生物的繁殖代謝可能促進(jìn)發(fā)酵食品中組胺的降解[3]。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加,蔗糖對組胺出現(xiàn)了明顯的抑制。發(fā)酵進(jìn)行中,部分蔗糖能夠與游離的蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮化合物進(jìn)行美拉德反應(yīng)[27],游離氨基酸含量下降,促進(jìn)了組氨酸的消耗,因此減少了組胺的生成。與此同時,美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物也具有良好的功能特性,不僅提升食品的質(zhì)量和營養(yǎng),對發(fā)酵中的部分微生物有抑制效果,還會使最終的產(chǎn)品得到獨特的香氣和滋味[28]。

水產(chǎn)品加工中,由于原料自身攜帶眾多微生物,在生產(chǎn)時容易大量繁殖引起食品腐敗,不僅破壞產(chǎn)品原有的感官性狀和營養(yǎng)價值,甚至產(chǎn)生毒性物質(zhì)。戴娟等[29]研究了蝦醬罐頭的品質(zhì)變化,以菌落總數(shù)為指標(biāo),可以直觀反映微生物代謝作用,菌落總數(shù)的變化對蝦醬揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量有較大影響。而虞姣姣等[30]研究了不同添加糖對發(fā)酵乳菌落活菌數(shù)的影響,結(jié)果表明糖類促進(jìn)菌種的增殖和活性。加入蔗糖后發(fā)酵產(chǎn)品菌落總數(shù)無較大差異,2%樣品的菌落總數(shù)在104～105CFU/g之間,其余均小于104CFU/g(GB 10133-2014中菌落總數(shù)的限定),符合標(biāo)準(zhǔn)。與對照組相比,4%和6%的蔗糖菌落總數(shù)略低,可能因為蔗糖含量較高會抑制微生物生長。而其中添加2%的蔗糖菌落總數(shù)高于對照組,可能因為較低含量的蔗糖可作為微生物營養(yǎng)源,促進(jìn)了部分微生物的活動。除此之外,在原有工藝添加食鹽的基礎(chǔ)上,蔗糖的添加進(jìn)一步引發(fā)滲透壓升高,對腐敗菌也形成了一定的抑制。

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是水產(chǎn)品質(zhì)量和新鮮度的重要指標(biāo),其含量越高,則產(chǎn)品新鮮度則越低。發(fā)酵進(jìn)行時,由于蛋白酶和腐敗菌的存在,就會生成這類含氮的堿基化合物,且具有揮發(fā)性,因此TVB-N含量的增加與腐敗微生物的活性呈正相關(guān)[31]。在發(fā)酵初期,微生物繁殖呈現(xiàn)對數(shù)增長,菌種活力強(qiáng)、代謝快,促進(jìn)了酶解反應(yīng),將原料中的蛋白質(zhì)變?yōu)橛坞x氨基酸,經(jīng)過脫羧酶或脫氨酶的進(jìn)一步催化,生成了氨氣等物質(zhì),使0～4 d時的TVB-N檢測含量大幅提高。4 d后,TVB-N含量出現(xiàn)拐點,除了揮發(fā)性所導(dǎo)致的散失,其主要原因是微生物活動受到抑制,高鹽和高溫也同時降低了酶活,遏制了氨基酸的進(jìn)一步反應(yīng),從而使TVB-N含量緩慢減少[32]。加入蔗糖后,對TVB-N的含量有一定程度的降低,但對其變化趨勢并無影響,且TVB-N的含量遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)450 mg/100 g(SB/T 10525-2009)。

氨基態(tài)氮(AA-N)是評價發(fā)酵食品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo),AA-N越高,則產(chǎn)品品質(zhì)越高,鮮味越好。發(fā)酵開始時,酶活力旺盛,微生物繁殖迅猛,蛋白質(zhì)作為底物被大量降解酶,酶解產(chǎn)物游離氨基酸和小分子肽的增幅明顯,因此測定的AA-N含量陡增,添加蔗糖對其并未產(chǎn)生影響。4 d后,微生物和酶的活性受環(huán)境抑制,AA-N含量趨于穩(wěn)定,蔗糖增加可能會增加發(fā)酵池的滲透壓,從而使AA-N含量略微低于對照組。蔗糖作為微生物的碳素營養(yǎng)源被微生物發(fā)酵利用,對快速發(fā)酵蝦頭醬中AA-N的含量及變化趨勢并無影響。此外,該工藝制備的蝦醬AA-N含量約0.65～0.70 g/100 g,高于同類產(chǎn)品[33]AA-N含量(0.50～0.62 g/100 g),滿足SC/T 3602-2016標(biāo)準(zhǔn)(0.6 g/100 g),有較高的營養(yǎng)價值。

2.4 感官評價比較

感官評價是食品評價體系中最直觀和最基本的方法,制定科學(xué)合理的指標(biāo),直接影響到產(chǎn)品安全和質(zhì)量的界定。優(yōu)質(zhì)蝦頭醬有明顯的發(fā)酵香氣,口感細(xì)膩,滋味濃醇。專業(yè)評定員對不同產(chǎn)品的感官評價結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同添加量蔗糖對蝦頭醬產(chǎn)品感官評價的影響Fig.6 The effects of different concentrations sucrose addition on sensory evaluation of shrimp paste

林耀盛等[34]以不同添加量的蔗糖,對風(fēng)干臘腸的風(fēng)味進(jìn)行研究分析,結(jié)果表明蔗糖的添加量與產(chǎn)品的醇類和醛類風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān),與酯類和酸類呈負(fù)相關(guān)。從結(jié)果來看,發(fā)酵產(chǎn)生氨氣味的感官評分依次為5.5、4.8和4.4(2%、4%和6%),均低于對照組,且刺激性氣味依次遞減。根據(jù)Meng等[35]的研究,添加蔗糖可增強(qiáng)谷氨酸脫氫酶系的活性,因此推測,在蝦醬發(fā)酵中,蔗糖的添加可能促進(jìn)氨的同化,減少刺激性氨氣的揮發(fā),有助于提升感官。但與對照組相比,6%蔗糖組的發(fā)酵味和蝦味評分依次下降了0.7和0.6,表明蔗糖量的增加對發(fā)酵香氣也出現(xiàn)輕微的掩蓋,影響感官評分。除此之外,當(dāng)蔗糖添加量為4%時,發(fā)酵鮮味的評分達(dá)到最高5.4,表明適量蔗糖的加入,推進(jìn)了發(fā)酵時伴隨的美拉德反應(yīng),有助于生成揮發(fā)性化合物,也能產(chǎn)生令人愉悅的香味[36]。與莫星優(yōu)等[14]的實驗結(jié)果相比,蔗糖添加后,氨氣味降低更明顯,甜味更易區(qū)分,但總體趨勢相近。

3 結(jié)論

本文通過理化性質(zhì)和安全性的測定和分析,綜合評價了不同添加量的蔗糖對快速發(fā)酵蝦醬產(chǎn)品品質(zhì)的影響。添加蔗糖對發(fā)酵產(chǎn)生的組胺有抑制作用,在一定的添加范圍內(nèi),抑制效果與添加量呈正相關(guān)。安全性檢測表明,蔗糖對產(chǎn)品的TVB-N、AA-N未產(chǎn)生影響,而較高添加量的蔗糖略微降低菌落總數(shù)。同時,pH和營養(yǎng)成分也無明顯改變,測定結(jié)果表明實驗組與對照組變化趨勢相近。感官評定顯示,低添加量蔗糖一定程度上能改善發(fā)酵蝦頭醬的不良風(fēng)味,增加香氣和產(chǎn)品色澤。結(jié)果顯示,4%～6%的添加蔗糖對產(chǎn)品品質(zhì)均有不同程度的改善,而超過6%的蔗糖則影響了蝦醬風(fēng)味。

蝦醬發(fā)酵中適量蔗糖的添加有助于產(chǎn)品品質(zhì)的提升,為快速發(fā)酵工藝的進(jìn)一步優(yōu)化奠定了理論基礎(chǔ)。但本次實驗并未確定蔗糖的最佳添加量,可以綜合工藝參數(shù),對4%～6%的蔗糖添加量細(xì)化實驗和研究指標(biāo),進(jìn)一步分析蝦醬綜合質(zhì)量。增加蔗糖是否會影響發(fā)酵劑的活性,特別是酵母的活性是否受到蔗糖的阻遏和抑制,在添加食鹽的基礎(chǔ)上,復(fù)合菌種的耐糖量和最適添加量也需進(jìn)一步實驗研究確定。