胡金梅,吳巧婷,謝晶晶,周 林

(1.廣東環(huán)境保護工程職業(yè)學(xué)院,廣東佛山 528216; 2.廣東藥科大學(xué),廣東廣州 510006)

火龍果(HylocereusundulatusBritt)又名紅龍果、青龍果、仙蜜果等,屬仙人掌科量天尺屬和蛇鞭柱屬植物?；瘕埞a(chǎn)于美洲地區(qū),在我國的貴州、云南、福建、兩廣地區(qū)均有種植[1]。目前栽培品種主要有紅皮白肉、紅皮紅肉、黃皮白肉三種。

火龍果皮是火龍果加工的主要副產(chǎn)品,通常被直接丟棄。果皮占整個火龍果質(zhì)量的25%左右,火龍果果皮含有一般植物少有的甜菜紅素(betalanins),其色澤鮮艷,是一種具有抗氧化[2]、降血脂[3]等生物活性的天然水溶性色素。雖然甜菜紅素可以從紅甜菜中提取,但紅甜菜中提取的甜菜紅素帶有土腥味、還含有吡嗪等有害物質(zhì);而火龍果中的甜菜紅素更具優(yōu)越性[4]。除了色素成分,火龍果皮中還含有豐富的果膠多糖。近年來,針對火龍果皮中色素、果膠成分提取的研究日益增多。如采用水和乙醇溶劑浸提、微波輔助提取甜菜紅色素[5-7]。采用酸提醇沉法、離子交換法、鹽沉淀法提取果膠[8-9]。

上述提取方法可以為火龍果資源開發(fā)所借鑒,但是傳統(tǒng)的水提法不易將果皮色素完全提取,且后續(xù)需要采用濃縮等方式[10],而乙醇溶劑容易破壞色素的性質(zhì)結(jié)構(gòu)[11],微波輔助等會產(chǎn)生熱量,均不利于色素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。此外,這些方法主要針對單一色素或果膠成分的提取,原料利用尚不充分,影響到火龍果資源開發(fā)的經(jīng)濟性。與上述分離技術(shù)相比,雙水相萃取技術(shù)具有生物相容性好,目標(biāo)產(chǎn)物活性損失少,操作條件溫和,無有機溶劑殘留,設(shè)備簡單,易于放大和連續(xù)操作等優(yōu)點,特別適用于生物物質(zhì)的分離和提純[12]。因而探討雙水相體系同時萃取分離火龍果皮中甜菜紅素和果膠的工藝對于火龍果皮的開發(fā)具有積極意義。已有研究報道,采用聚乙二醇(PEG)/硫酸銨雙水相體系,可同時萃取甜菜根中的紅色素和多糖,70%～75%紅色素被富集到聚合物上相,鹽下相可富集80%～90%的多糖[13]。本研究采用雙水相體系中常見的PEG/硫酸銨體系,考察成相聚合物PEG的相對分子質(zhì)量和質(zhì)量分數(shù)、鹽的質(zhì)量分數(shù)、體系pH對色素和果膠提取的影響,為火龍果果皮的綜合利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣西金都一號紅心火龍果 佛山南海農(nóng)貿(mào)市場采購;聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)1000、2000、4000、6000 化學(xué)純,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司;硫酸銨、氫氧化鈉、濃鹽酸、無水乙醇 分析純,廣州化學(xué)試劑有限公司。

Bruker Tensor II傅里葉紅外光譜 布魯克儀器有限公司;UV-1800分光光度計 島津儀器有限公司;KQ-300V型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;GZX.9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;RE.52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、小型電動粉碎機 上海亞榮生化儀器廠;雷磁PHS-3C酸度計 上海精密科學(xué)儀器廠;AnkiTDL離心機 上海安亭科學(xué)儀器;DZ-2BC II型真空干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原材料的處理 選用新鮮火龍果果皮,除去雜質(zhì),避光風(fēng)干,粉碎機粉碎,過10目篩,得到果皮干粉置于玻璃干燥器內(nèi)室溫、避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PEG/鹽雙水相體系建立 稱取適量PEG,加入一定量水?dāng)嚢枞芙?加入適量硫酸銨,磁力攪拌器混合,再加入適量火龍果皮干粉,繼續(xù)攪拌30 min,靜置待兩相分層。分別收集上相、下相溶液,記錄體積V上和V下,計算相比R。

計算公式:

1.2.3 雙水相分離條件研究 采用單因素法分別考察PEG相對分子量和濃度、體系pH、硫酸鹽質(zhì)量分數(shù)等因素對火龍果皮中色素含量和果膠萃取得率的影響,確定最佳雙水相萃取條件。

1.2.3.1 PEG相對分子量的影響 分別稱取30 g不同相對分子量PEG(1000、2000、4000、6000),加100 mL水溶解后,加入30 g硫酸銨,再加入1 g火龍果皮干粉攪拌均勻,溶液體系pH約5.0,計算雙水相的相比,色素與果膠的得率。

1.2.3.2 雙水相體系pH的影響 分別將30 g PEG2000、PEG4000用80 mL水溶解后,加入30 g硫酸銨攪拌,用鹽酸將pH分別調(diào)至2、3、4、5,加水至100 mL,再加入1 g火龍果皮干粉,攪拌均勻,按照1.2.2方法進行操作,取適量上相紅色素提取液,室溫靜置48 h后,在400～650 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描。考察體系pH對萃取紅色素的穩(wěn)定性影響。

1.2.3.3 硫酸銨質(zhì)量分數(shù)的影響 稱取30 g PEG4000,加100 mL水溶解后,分別加入不同質(zhì)量(5、10、15、20、25、30) g的硫酸銨,對應(yīng)的質(zhì)量分數(shù)分別為4%、7%、10%、13%、16%、19%,用鹽酸調(diào)至pH4,再加入1 g火龍果皮干粉攪拌均勻,按照1.2.2方法進行操作,計算雙水相的相比,色素與果膠的得率。

1.2.3.4 PEG質(zhì)量分數(shù)的影響 分別稱取不同質(zhì)量(5、10、15、20、25、30) g的 PEG4000、PEG6000,對應(yīng)的質(zhì)量分數(shù)分別為7%、10%、13%、16%、19%,加100 mL水溶解后,加入30 g硫酸銨攪拌溶解,用鹽酸調(diào)至pH4,再加入1 g火龍果皮干粉攪拌均勻,按照1.2.2方法進行操作,計算雙水相的相比,色素與果膠的得率。

1.2.4 色素提取液的測定

1.2.4.1 可見分光光譜掃描測試 火龍果皮經(jīng)PEG/硫酸銨雙水相萃取,上、下相分離后,取適量上相紅色素提取液,用去離子水稀釋后,在400～650 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描。

1.2.4.2 紅色素含量和得率的測定 參考文獻方法[14],采用摩爾消光系數(shù)法計算紅色素粗取液中的甜菜紅素含量。

甜菜紅素含量(g/L)=(OD538×550.11)/61600

式中:OD538為吸光值;550.11為標(biāo)準(zhǔn)甜菜紅素摩爾分子量;61600為標(biāo)準(zhǔn)甜菜紅素摩爾消光系數(shù)。

甜菜紅素得率按照下式計算:

甜菜紅素得率(%)=[(C×N×V)/M]×100

式中:C為提取液中甜菜紅素含量,g/L;N為稀釋倍數(shù);V為提取液體積,L;M為火龍果皮干重,g。

1.2.5 果膠的測定

1.2.5.1 果膠的純化 火龍果皮經(jīng)PEG/鹽雙水相萃取,上、下相分離后,將下相提取物過濾,得到濾渣用20 mL水清洗3次去鹽,再用80 ℃熱水浸提30 min,然后過濾除渣。參考文獻[15]方法,濾液加入1.5倍體積的95%乙醇后靜置40 min,離心分離,收集離心沉淀,得到的凝膠狀液體即果膠,于55 ℃條件下干燥至恒重,稱量,并采用紅外光譜進行表征分析。

1.2.5.2 紅外光譜定性分析 采用紅外光譜儀,壓片法測定。將干燥的果膠樣品與KBr壓制成片,在4000～400 cm-1波數(shù)范圍掃描測定光譜吸收值。

1.2.5.3 果膠得率計算公式

1.3 數(shù)據(jù)處理

色素和果膠的得率重復(fù)測定三次取平均值,采用Sigmaplot 14.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG相對分子量對萃取的影響

考察PEG相對分子量對色素和果膠的影響,實驗結(jié)果顯示,當(dāng)雙水相體系鹽質(zhì)量分數(shù)一定時,隨著PEG相對分子量(1000、2000、4000、6000)增加,可以觀察到上相中紅色素的顏色逐漸加深;同時上相體積也逐漸增大,當(dāng)PEG相對分子量達到4000以上,相比開始趨于平穩(wěn)(圖1a)。上相中紅色素和下相中果膠的得率隨著PEG相對分子量的增加也呈上升趨勢(圖1b)。因此,PEG相對分子量增加有利于紅色素和果膠的分離。但是隨著PEG相對分子量增大,溶液的粘度也逐漸增大。因此,考慮到對于后續(xù)分離操作的影響,PEG的相對分子量選擇4000和6000較為合適。

圖1 PEG相對分子量對PEG/(NH4)2SO4 雙水相系統(tǒng)相比、色素和果膠得率的影響Fig.1 Effect of PEG relative molecular weight on phase volume ratio,yield of pigment and pectin under PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system

2.2 雙水相體系pH對萃取的影響

火龍果紅色素在堿性條件下不穩(wěn)定,文獻中已有相關(guān)分析[16],因此實驗主要考慮pH<6的酸性條件下雙水相體系pH對紅色素和果膠的影響。另外,實驗過程中發(fā)現(xiàn)PEG分子量低時,提取的紅色素在室溫放置時褪色較為明顯。因此,為了更好的分析雙水相體系pH對色素的影響,選取了PEG2000和PEG4000與硫酸銨形成雙水相體系,分別調(diào)節(jié)pH至2、3、4、5,考察體系pH對萃取紅色素的穩(wěn)定性影響。

通過肉眼觀察結(jié)合圖2分析表明:采用PEG4000,pH3～5時,紅色素的吸收光譜曲線較為穩(wěn)定,但是當(dāng)pH2時,紅色提取液放置48 h后,褪色嚴重,大部分降解為橙黃色。采用PEG2000時,紅色素提取液的顏色均較相應(yīng)的PEG4000色素提取液淺,室溫放置48 h后,紅色素褪色顯著。且pH越低,紅色素褪色越明顯,雙水相體系pH2時,紅色素完全退色,降解為橙黃色。因而,火龍果中紅色素的穩(wěn)定性受pH影響較大。在 pH4～5范圍內(nèi),火龍果果皮紅色素保持鮮紅色,其最大吸收波長在538 nm附近;pH2～3時色素溶液呈紫紅色,且很快會褪色。這可能與酸性條件下,甜菜苷C15發(fā)生異構(gòu)化或脫氫反應(yīng)有關(guān)[17]。另外,有研究報道,采用酸提醇沉提取火龍果皮果膠的最佳pH為4[15,18]。結(jié)合上述認為采用雙水相體系同時提取火龍果紅色素和果膠的pH為4。

圖2 PEG/(NH4)2SO4 雙水相體系的 pH對紅色素可見光譜的影響Fig.2 Effect of pH of PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system on visible spectrum of red pigment

2.3 硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對萃取的影響

由圖3可知,硫酸銨質(zhì)量分數(shù)在4%～19%的范圍內(nèi),隨著硫酸銨質(zhì)量分數(shù)的增加,相比逐漸減少,上相中紅色素和下相中果膠的得率逐漸增加。當(dāng)硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)低于7%時,雙水相體系分相不明顯,色素和果膠的得率低。因此硫酸銨的質(zhì)量分數(shù)對提取的影響較大。但是隨著硫酸銨質(zhì)量分數(shù)增加,會導(dǎo)致溶液粘度增加,造成下相溶液中果膠后續(xù)分離的問題,因而后續(xù)實驗中硫酸銨質(zhì)量分數(shù)設(shè)定為19%。

圖3 硫酸銨質(zhì)量分數(shù)對PEG/(NH4)2SO4 雙水相相比、色素和果膠得率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate weight fraction on phase volume ratio,yield of pigment and pectin under PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system

2.4 PEG質(zhì)量分數(shù)對萃取的影響

如圖4a所示,PEG的質(zhì)量分數(shù)較少時,上相體積小,色素不能完全富集到上相,隨著PEG質(zhì)量分數(shù)的增加,雙水相體系的相比呈上升趨勢,即上相體積隨PEG質(zhì)量分數(shù)的增加而增大。當(dāng)PEG質(zhì)量分數(shù)增加到13%,可觀察到紅色素全部富集在上相,且上、下相體積接近。隨著PEG質(zhì)量分數(shù)增加(圖4b與圖4c),上相中的紅色素和下相中的果膠的得率隨之增大。但是隨著PEG質(zhì)量分數(shù)的增加,溶液體系的粘度也增大,會導(dǎo)致相間分子轉(zhuǎn)移的阻力增加。當(dāng)PEG6000質(zhì)量分數(shù)達到13%時,色素和果膠的得率分別為1.64%±0.04%、3.74%±0.15%,當(dāng)PEG質(zhì)量分數(shù)進一步增加至16%時,色素的得率增加至1.80%±0.04%,果膠的得率減少至3.68%±0.13%;PEG質(zhì)量分數(shù)進一步增加至19%時,色素得率(1.82%±0.04%)略有增加,但是果膠得率有所減少。因而實驗條件下,采用PEG6000分離色素的最大提取率(1.82%±0.04%)略高于PEG4000(1.74%±0.04%)。

綜上,隨著雙水相體系PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)增加,火龍果皮中色素和果膠的得率都會增加,當(dāng)相比接近0.5時,上相紅色素和下相果膠得到較好的分離,色素和果膠的得率均達到最大。而當(dāng)PEG質(zhì)量分數(shù)持續(xù)增加,由于上相粘度和溶液疏水等性質(zhì)的改變,分離時會有少量果膠進入上相,導(dǎo)致下相中果膠減少。如果優(yōu)先考慮應(yīng)用價值較大的火龍果皮色素得率最大化,確定雙水相分離火龍果皮色素和果膠的優(yōu)化條件為:采用質(zhì)量分數(shù)16%的PEG6000,硫酸鹽質(zhì)量分數(shù)19%,雙水相體系pH4.0,上相中紅色素和下相中果膠的得率分別為1.82%±0.04%、3.68%±0.13%,所提取的紅色素得率略高于乙醇溶劑提取法[11],果膠的得率也較其他采用酸提醇沉法略高[8],因此,雙水相同時萃取分離火龍果皮中的色素和果膠,較其他只提取單一物質(zhì)的工藝具有一定的優(yōu)勢。

圖4 PEG分子量和質(zhì)量分數(shù)對PEG/(NH4)2SO4 雙水相溶液相比、色素和果膠得率的影響Fig.4 Effect of relative molecular weight and weight fraction of PEG on phase volume ratio,yield of pigment and pectin under PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system

圖5 火龍果皮經(jīng)PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)分離后 上相色素提取物的可見吸收光譜Fig.5 Visible absorption spectrum of pigment extract from upper phase of aqueous two-phase system of PEG/(NH4)2SO4 from pitaya peel

2.5 色素提取液的可見吸收光譜

火龍果皮色素提取液經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后,于紫外-可見分光光度計400～650 nm進行掃描,得到吸收光譜曲線。由圖5可見,火龍果皮中紅色素的最大吸收波長538 nm,與已有文獻報道一致[10-11]。鑒于對火龍果中甜菜苷色素的基本性質(zhì)及結(jié)構(gòu)已有報道[19-21]。初步推斷雙水相體系分離出的紅色提取液含有甜菜紅素。

2.6 提取果膠的紅外光譜

火龍果皮采用雙水相系統(tǒng)分離得到的下相提取物,經(jīng)乙醇沉淀后的干燥物采用紅外光譜儀掃描(圖6)。3100～2800 cm-1間的吸收峰是由C-H吸收引起的,主要包括-CH、-CH2和-CH3的伸縮振動。1760～1730和1630～1600 cm-1間的吸收峰,分別是酯化的羰基和未酯化的羰基紅外吸收引起[8-9],此處的吸收峰很弱,說明所得果膠為低酯果膠[22]。此外,1394 cm-1附近還有一個較強的羰基(-COOH)對稱吸收峰;1300～800 cm-1間有一些中等強度吸收峰,這些峰是果膠的指紋區(qū),1100～1000 cm-1之間還有R-O-R和C-C的吸收峰,樣品在1045 cm-1的特征峰是C-O-C的伸縮振動峰,表明有甲氧基存在。甲氧基是果膠的主要官能團,王雪等[8-9]也發(fā)現(xiàn)火龍果皮中果膠屬于低酯、低甲氧基果膠。因此,經(jīng)對比可知所測樣品具有果膠的特征吸收峰,火龍果皮中提取的樣品為低酯果膠。

圖6 火龍果皮經(jīng)PEG/(NH4)2SO4 雙水相系統(tǒng)分離后下相提取物的紅外光譜Fig.6 Infrared spectroscopy of extract from lower phase of aqueous two-phase system of PEG/(NH4)2SO4 from pitaya peel

3 結(jié)論

采用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系在室溫條件下可以同時分離富集火龍果皮中色素和果膠。通過考察PEG相對分子量、PEG和硫酸鹽質(zhì)量分數(shù)和體系pH對PEG/硫酸鹽雙水相體系分離火龍果皮中紅色素和果膠萃取的影響。發(fā)現(xiàn)PEG相對分子量、PEG和硫酸鹽質(zhì)量分數(shù)的增加,均有利于紅色素在上相,果膠在下相富集;但是PEG相對分子量和PEG質(zhì)量分數(shù)的進一步增加,會導(dǎo)致溶液體系的粘度增大,不利于后續(xù)的精制過程。研究建立了優(yōu)化的PEG/硫酸鹽雙水相體系分離條件,即采用質(zhì)量分數(shù)16%的PEG6000,質(zhì)量分數(shù)19%硫酸銨,pH4.0,在此條件下火龍果皮中色素和果膠的得率分別為1.82%±0.04%、3.68%±0.13%。論文研究工作可以為火龍果皮中紅色素和果膠的開發(fā)利用提供參考。