劉詩妤,陳忠正,林曉蓉,張媛媛,周浪花,高 雄,李 斌,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642; 2.廣東省科學(xué)院廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070)

南昆山毛葉茶(CamelliaptilophyllaChang)是二十世紀(jì)八十年代初中山大學(xué)植物分類學(xué)家張宏達(dá)教授在廣東省龍門縣南昆山首次發(fā)現(xiàn)的一種天然低或無咖啡堿的茶樹資源[1]。與傳統(tǒng)茶葉[Camelliasinensis(L).O.Kuntze]同屬不同種,其主要代謝產(chǎn)物——兒茶素、生物堿具有明顯差異,傳統(tǒng)茶葉以順式兒茶素和咖啡堿含量高,而南昆山毛葉茶以反式兒茶素和可可堿含量高[2-3]。功能特性研究表明,該茶葉具有抗氧化[4]、抗癌[5]、抗肥胖[6]、抗血管生成[7]等功能。2011年P(guān)eng等[4]以南昆山毛葉白茶、綠茶、紅茶為材料,采用化學(xué)抗氧化法,與龍井、碧螺春、英紅九號、祁門紅茶等比較發(fā)現(xiàn),南昆山毛葉綠茶的抗氧化性顯著強(qiáng)于其他茶類。2012年Li等[8]用化學(xué)抗氧化法比較南昆山毛葉茶、苦茶、龍井茶抗氧化性的結(jié)果表明,南昆山毛葉茶抗氧化活性最強(qiáng)。2017年高雄等[9]采用細(xì)胞抗氧化活性法(cellular antioxidant activity,CAA)和化學(xué)抗氧化法研究表明,南昆山毛葉茶水提物抗氧化性強(qiáng)于云南大葉種茶水提物;2019年曠小珊等[2]采用化學(xué)抗氧化法及氧化應(yīng)激細(xì)胞模型法研究南昆山毛葉茶中多酚物質(zhì)的抗氧化活性表明,沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate,GCG)具有較強(qiáng)的化學(xué)抗氧化活力,但其抗氧化機(jī)理并未深入研究。

正常人體內(nèi)存在氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡,氧化應(yīng)激則是由于體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除能力降低,引起體內(nèi)平衡發(fā)生紊亂,自由基大量積累,導(dǎo)致細(xì)胞衰老和組織損傷[10-11]。自由基主要由活性氧自由基和活性氮自由基組成,抗氧化系統(tǒng)則分為酶系統(tǒng)[過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)]和非酶系統(tǒng)[谷胱甘肽(glutathione,GSH)、維生素E、輔酶Q10][12-13]。目前抗氧化研究可分為體內(nèi)和體外二類。體內(nèi)抗氧化法成本高、耗時長。體外抗氧化法又可分為化學(xué)抗氧化法和細(xì)胞模型法,其中細(xì)胞模型法具有用時短、成本低,比化學(xué)抗氧化法更具生物相關(guān)性,結(jié)果更具說服力等優(yōu)點(diǎn)[14]。常用的細(xì)胞模型造模劑有叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)、過氧化氫等。tBHP是一種脂質(zhì)的短鏈氫過氧化物類似物,與H2O2相比,化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定,不易降解,因此應(yīng)用廣泛[15-16]。tBHP在損傷過程中產(chǎn)生叔丁基自由基,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,蛋白質(zhì)巰醇基修飾和胞質(zhì)鈣離子濃度失調(diào),膜滲透能力變化[17]。研究發(fā)現(xiàn),tBHP可導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡,但也能導(dǎo)致壞死,甚至是鐵死亡[16-18]。

為探討南昆山毛葉茶抗氧化的作用機(jī)理,本研究采用tBHP作為誘導(dǎo)損傷劑,構(gòu)建NIH3T3細(xì)胞氧化應(yīng)激模型,在全面分析茶葉水提物的茶多酚等理化成分含量基礎(chǔ)上,通過測定細(xì)胞存活率、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成量、抗氧化酶活性以及線粒體膜電位,研究其抗氧化活性,并通過測定凋亡蛋白的表達(dá),系統(tǒng)地探究其觸發(fā)細(xì)胞死亡途徑及保護(hù)損傷機(jī)理,為南昆山毛葉茶的抗氧化等功能特性研究和開發(fā)利用提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南昆山毛葉茶 2019年4月采自廣東省惠州市龍門縣南昆山采用微波殺青、微波干燥加工成干茶;NIH3T3細(xì)胞 源于廣東省微生物研究所;杜氏改良高糖培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)、胰蛋白酶、杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline,DPBS)、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS) 美國Gibco公司;1%青霉素(100U/mL)和鏈霉素(100μg/mL) 瑞典Hyclone公司;SOD、CAT、GSH-Px活性檢測試劑盒、MMP檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司;LDH、T-GSH、MDA檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;caspase-3、caspase-9檢測試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;細(xì)胞色素c、β-actin抗體 美國CST公司;MTT、兒茶素[(-)-catechin,C，≥98%]、表兒茶素(epicatechin,EC,≥98%)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate,CG,≥98%)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC,≥98%)、沒食子兒茶素(gallocatechin,GC,≥98%)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG,≥98%)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG,≥98%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG,≥95%)、沒食子酸(gallic acid,GA,≥97.5%～102.5%)、可可堿(≥99%)、茶堿(≥99%)、茶氨酸(≥98%) 美國Sigma公司;咖啡堿(99.9%) 上海生工生物有限公司;三氟乙酸色譜級、福林酚 麥克林生化科技有限公司;乙腈色譜級 德國Merck公司;硫酸分析純 廣州化學(xué)試劑廠;Poroshell 120 Bonus-RP色譜柱(4.6 mm×50 mm,2.7 μm) 美國Agilent公司。

Milli-Q Integral 3純水機(jī) 德國Merk-Millipore公司;Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司;VersaMax酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;Agilent 1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Axio Observer A1倒置熒光顯微鏡 德國Carl Zeiss公司;CytoFLEx流式細(xì)胞儀 美國Beckman Coulter;OmegaLum G化學(xué)發(fā)光儀 美國Aplegen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南昆山毛葉茶水提物制備 取干茶用研缽磨碎并篩分(20～30目),按茶水比1∶25 (w/v)加入100 ℃的一級水,100 ℃水浴浸提45 min,隔10 min振搖一次,趁熱抽濾,濾液冷凍干燥,-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 南昆山毛葉茶水提物主要化學(xué)成分含量測定

1.2.2.1 茶多酚的測定 采用福林酚比色法[19],適當(dāng)修改。稱取一定量的茶葉水提物,配制成0.2 mg/mL的試液,取1與5 mL福林酚試劑(10%)混合,反應(yīng)5 min內(nèi),加入7.5%的Na2CO3溶液4 mL,混勻,加水定容,避光放置60 min。測定樣品在765 nm波長下的吸光值,以GA為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0109x+0.0035,R2=0.9995,計算樣液中茶多酚濃度(mg/mL),并換算成占茶葉水提物的百分比(%),換算公式如下:

式中:C1:經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣液中的茶多酚濃度(mg/mL);C2:加入的水提物濃度(mg/mL)。

1.2.2.2 兒茶素和生物堿的測定 參照Gao等[5]測定兒茶素生物堿含量的方法,進(jìn)行適當(dāng)修改。使用Agilent 1200高效液色譜儀及Poroshell 120 Bonus-RP(4.6 mm×50 mm,2.7 μm)色譜柱進(jìn)行分離,柱溫30 ℃,檢測波長為280 nm,進(jìn)樣量為5 μL,流動相A為乙腈,B為0.05%三氟乙酸,進(jìn)行線性梯度洗脫(0～26 min,A:0～28%,B:100%～72%),流速為0.8 mL/min,后運(yùn)行4 min。由Agilent Chemstation B.04.02軟件積分,擬合兒茶素和生物堿單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如表1),采用歸一化法計算其濃度(mg/mL),并換算成占茶葉水提物的百分比(%),換算公式如下:

式中:C1:經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣液中的兒茶素/生物堿單體的濃度(mg/mL);C2:加入的水提物濃度(mg/mL)。

表1 兒茶素和生物堿單體的標(biāo)準(zhǔn)曲線表Table1 Stadard curves of catechin and alkaloid monomer

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3經(jīng)解凍復(fù)蘇后,培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,每隔2 d繼代一次。培養(yǎng)液組成為89%的DMEM培養(yǎng)基、10% FBS、1%青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)。

1.2.4 tBHP誘導(dǎo)損傷NIH3T3細(xì)胞模型的建立

1.2.4.1 誘導(dǎo)劑tBHP誘導(dǎo)損傷NIH3T3細(xì)胞濃度的確定 將NIH3T3細(xì)胞以5×104cell/mL,每孔200 μL,接種于96孔板中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,棄去舊培養(yǎng)液,同時加入100 μL tBHP溶液和100 μL新鮮培養(yǎng)液,使tBHP終濃度分別為0、25、50、100、200、300、400 μmol/L,24 h后棄去,加入MTT溶液,37 ℃培養(yǎng)2 h后棄去,加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),37 ℃,100 r/min振搖15 min,用酶標(biāo)儀測定其在550 nm處的吸光值。細(xì)胞存活率計算公式如下:

式中:As:不同濃度茶葉水提物處理后的吸光值;Ac:正常培養(yǎng)對照組的吸光值,將正常培養(yǎng)對照組細(xì)胞存活率當(dāng)做100%。

其中正常培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞為對照組,以使細(xì)胞存活率為50%～60%的tBHP濃度為誘導(dǎo)劑合適作用濃度。

1.2.4.2 南昆山毛葉茶水提物對NIH3T3細(xì)胞存活率影響的測定 細(xì)胞鋪板培養(yǎng)同1.2.4.1,24 h后棄去舊培養(yǎng)液,同時加入100 μL茶葉水提物和100 μL新鮮培養(yǎng)液,使茶葉水提物終濃度分別為25、50、100、200、300、400 μg/mL,培養(yǎng)24 h后棄去,同1.2.4.1方法測定細(xì)胞存活率。

1.2.4.3 南昆山毛葉茶水提物對tBHP誘導(dǎo)損傷NIH3T3細(xì)胞存活率影響的測定 細(xì)胞鋪板培養(yǎng)同1.2.4.1,24 h后棄去舊培養(yǎng)液,同時加入100 μL茶葉水提物(終濃度分別為25、50、100 μg/mL)和100 μL tBHP溶液(終濃度為200 μmol/L),24 h后棄去,同1.2.4.1方法測定細(xì)胞存活率。正常培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞為對照組,tBHP單獨(dú)處理為tBHP損傷組,tBHP和南昆山毛葉茶水提物共處理為樣品組。

1.2.5 南昆山毛葉茶水提物處理NIH3T3細(xì)胞相關(guān)抗氧化指標(biāo)測定

1.2.5.1 LDH酶活力的測定 細(xì)胞鋪板培養(yǎng)及加樣同1.2.4.3一致,tBHP和茶葉水提物共同作用24 h后,取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按試劑盒說明書,測定LDH活性。

1.2.5.2 抗氧化酶活力及MDA、GSH含量的測定 將NIH3T3細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,細(xì)胞培養(yǎng)、加樣及細(xì)胞分組同1.2.4.3一致,各處理組細(xì)胞經(jīng)tBHP和水提物培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞,用相應(yīng)的細(xì)胞液裂解液充分裂解后,離心,取上清,以BCA蛋白定量試劑盒測定的細(xì)胞蛋白濃度為基礎(chǔ),按各試劑盒說明,分別測定SOD、CAT、GSH-Px的酶活力和MDA、GSH含量。

1.2.5.3 ROS含量的測定 將NIH3T3細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)、加樣方式及細(xì)胞分組同1.2.4.3一致,tBHP和水提物共培養(yǎng)6h,棄去,加入2′,7′-二氯熒光素雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)熒光探針溶液,37 ℃中避光孵育30 min,置于倒置熒光顯微鏡下觀察,進(jìn)行定性分析,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析。

1.2.5.4 MMP的測定 同1.2.5.3方法接種細(xì)胞于6孔板中,加樣及細(xì)胞分組同1.2.4.3方法一致,共培養(yǎng)24 h,按試劑盒說明書的方法,孵育熒光染料,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測 同1.2.5.2方法處理細(xì)胞并同1.2.4.3方法對其細(xì)胞進(jìn)行分組,得到各處理組的細(xì)胞蛋白上清液,分別按5×上樣緩沖液與蛋白樣品1∶4 (v/v)比例混合煮沸后,插入冰上分裝使用。以每孔20 μg蛋白上樣量對蛋白進(jìn)行電泳分離,濕轉(zhuǎn)至膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,分別用細(xì)胞色素c及β-actin一抗,4 ℃孵育過夜;隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1h,化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影,OmegaLum G化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并拍照記錄結(jié)果。

同1.2.5.2方法處理細(xì)胞,得到各處理組的細(xì)胞蛋白上清液,按照caspase-9、caspase-3試劑盒的方法對凋亡蛋白caspase-9、caspase-3的表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

圖表數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次以上。利用軟件Origin Pro 9.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖。采用FluorChem分析蛋白條帶光密度,以β-actin為內(nèi)參蛋白做相對定量。采用CytExpert 2.0分析流式細(xì)胞儀結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 南昆山毛葉茶水提物主要理化組成分析

為明確南昆山毛葉茶水提物的主要理化成分含量,本研究采用全量法提取、凍干,得到水提物,其得率為40.37%。采用相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)等方法,測定茶多酚等主要理化成分含量并分析計算,結(jié)果如表2所示。

表2 南昆山毛葉茶水提物主要理化成分含量Table 2 Contents of major chemical components in water extracts of Camellia ptilophylla Chang

由表2結(jié)果可知,南昆山毛葉茶水提物含有約13.06%的生物堿,其以可可堿為主,占比高達(dá)99.92%,咖啡堿含量極低,未檢測到茶堿;水提物含有較高比例的茶多酚,其中主要兒茶素單體占比為66.71%,且以GCG含量最高,占總兒茶素的54.19%;兒茶素組成以反式構(gòu)象、酯型和焦酚型結(jié)構(gòu)為主,占總兒茶素比例依次為80.73%、71.06%、76.52%。茶葉的抗氧化活性不僅受茶多酚含量影響,還與多酚組成有關(guān)[8]。Guo 和沈生榮等[20-21]研究表明,在較低濃度下(0.02 mmol/L),反式兒茶素GCG、GC、C清除自由基能力強(qiáng)于其差向異構(gòu)體,其空間構(gòu)象比順式兒茶素更穩(wěn)定,清除自由基效果更好。曠小珊等[2]發(fā)現(xiàn)GCG在30～60 μg/mL濃度范圍內(nèi),清除DPPH自由基能力強(qiáng)于EGCG。3個相鄰羥基是兒茶素清除自由基的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),酯型、焦酚型兒茶素清除自由基能力強(qiáng)于非酯型、兒茶酚型結(jié)構(gòu)[22]。在前人研究基礎(chǔ)上,本研究對南昆山毛葉茶水提物這一茶多酚含量豐富,兒茶素含量高,且反式、酯型和焦酚型兒茶素占比高,而具有強(qiáng)抗氧化功效的可能機(jī)理開展相關(guān)研究。

2.2 NIH3T3細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建

為探究南昆山毛葉茶抗氧化活性,本研究以tBHP為誘導(dǎo)劑,采用NIH3T3細(xì)胞建立氧化損傷模型。結(jié)果如圖1所示,不同濃度tBHP對NIH3T3細(xì)胞損傷程度不同;隨著tBHP濃度的提高,細(xì)胞存活率逐漸降低。在濃度為200 μmol/L時,細(xì)胞存活率為54.00%,達(dá)到建模要求,故以該濃度建立氧化損傷模型。

圖1 不同濃度tBHP對NIH3T3細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of tBHP on the viability of NIH3T3 cells注:*代表樣品組與對照組相比,*有顯著差異, 即P<0.05,**有極顯著差異,即P<0.01。

2.3 南昆山毛葉茶水提物對NIH3T3細(xì)胞存活率的影響

在探究茶葉樣品對NIH3T3細(xì)胞氧化應(yīng)激保護(hù)作用之前,本研究采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),確定茶葉水提物無毒副作用的濃度范圍,以防止其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,結(jié)果如圖2所示。

圖2 南昆山毛葉茶中水提物對NIH3T3細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of Camellia ptilophylla Chang water extract on the viability of NIH3T3 cells 注:*代表樣品組與對照組相比,*有顯著差異, 即P<0.05,**有極顯著差異,即P<0.01。

由圖2結(jié)果可知,與對照組相比,南昆山毛葉茶水提物在25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi),細(xì)胞存活率無顯著差異,在200～400 μg/mL濃度范圍內(nèi),隨著其濃度增加,NIH3T3細(xì)胞存活率極顯著下降,低于89.38%,顯示在該濃度范圍內(nèi)的南昆山毛葉茶水提物對該細(xì)胞的正常生長有毒副作用。故選擇南昆山毛葉茶水提物25～100 μg/mL的濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 南昆山毛葉茶水提物對tBHP損傷NIH3T3細(xì)胞的保護(hù)作用

LDH作為細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志性酶,其釋放與細(xì)胞膜完整性相關(guān)[23]。LDH含量越高,表示細(xì)胞膜損傷程度越大,當(dāng)損傷達(dá)到一定程度時,細(xì)胞死亡,整體存活率降低。因此本研究用MTT法測定南昆山毛葉茶水提物對tBHP誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞存活率的影響,用試劑盒法檢測LDH活性,分析細(xì)胞損傷程度,結(jié)果如圖3所示。

圖3 南昆山毛葉茶水提物對tBHP誘導(dǎo)的 NIH3T3細(xì)胞存活率及細(xì)胞上清LDH活性的影響Fig.3 Effects of Camellia ptilophylla Chang water extract on the viability of tBHP-induced NIH3T3 cells andthe activity of LDH in cell supernatant注:A:細(xì)胞存活率;B:LDH活性;#代表tBHP組與對照組 相比,*代表樣品組與tBHP組相比,#(*)有顯著差異, 即P<0.05,##(**)有極顯著差異,即P<0.01。

圖3表明,200 μmol/L的tBHP使NIH3T3細(xì)胞存活率降低至49.68%,LDH酶的活力顯著提高,提高至對照組的1.43倍。當(dāng)加入的南昆山毛葉茶水提物濃度在25～100 μg/mL范圍內(nèi)時,能極顯著提高NIH3T3細(xì)胞存活率和降低LDH酶活性,并呈劑量依賴關(guān)系。說明200 μmol/L的tBHP會損傷NIH3T3細(xì)胞,但加入特定濃度的南昆山毛葉茶水提物后,能減輕細(xì)胞膜損傷程度,提高細(xì)胞存活率,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

2.5 氧化應(yīng)激模型中SOD、CAT、GSH-Px酶活力和MDA、GSH含量的變化

SOD、CAT、GSH-Px均為內(nèi)源性抗氧化酶,其活力增高代表細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性增強(qiáng)[24]。MDA是脂質(zhì)過氧化的第二產(chǎn)物,其含量越高代表脂質(zhì)氧化程度越高,因此被廣泛作為評價氧化應(yīng)激狀態(tài)的主要指標(biāo)[25]。GSH是主要的氧化還原緩沖物,可清除ROS,含量越高,清除的ROS越多[26]。因此本研究采用試劑盒法檢測南昆山毛葉茶對tBHP誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px抗氧化酶活力以及MDA、GSH的含量的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 南昆山毛葉茶水提物對tBHP損傷NIH3T3細(xì)胞的SOD、CAT、GSH-Px酶活力和MDA、GSH含量的影響Fig.4 Effects of Camellia ptilophylla Chang water extract on the activity of SOD，CAT，GSH-Px and contents of MDA,GSH by tBHP damage in NIH3T3 cells注:A:CAT酶活力;B:SOD酶活力;C:GSH-Px酶活力;D:MDA含量;E:GSH含量;#代表tBHP組與對照組相比, *代表樣品組與tBHP組相比,#(*)有顯著差異,即P<0.05,##(**)有極顯著差異,即P<0.01。

據(jù)圖4結(jié)果可知,tBHP處理的NIH3T3細(xì)胞,與對照組相比,SOD、CAT、GSH-Px三種抗氧化酶活力和GSH含量極顯著降低;而MDA含量極顯著升高。而加入南昆山毛葉茶水提物的樣品組,在25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi),三種抗氧化酶的活力均升高,且與tBHP組之間存在極顯著差異,其中SOD和GSH-Px酶活力在茶葉水提物濃度為25 μg/mL時達(dá)到最高值,而CAT酶活力在50 μg/mL時方達(dá)到最高值;MDA含量極顯著降低,并呈濃度依賴關(guān)系;GSH含量顯著提高。綜上所述,tBHP通過降低細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px酶活力,導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)氧化,MDA大量形成,GSH耗竭,從而打破體內(nèi)氧化-抗氧化平衡,進(jìn)而使細(xì)胞損傷。而南昆山毛葉茶水提物在本實(shí)驗(yàn)的25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi),能顯著提高三種抗氧化酶的活力,抑制MDA的形成,提高GSH含量,從而對tBHP誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞氧化損傷起到保護(hù)作用,其中濃度為25 μg/mL時效果最佳。

2.6 氧化應(yīng)激模型中ROS含量和MMP變化

ROS是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷的主要因素,ROS含量越高,表明細(xì)胞損傷越大[24]。MMP指生物膜兩側(cè)離子濃度不同而產(chǎn)生的跨膜電位差,反應(yīng)了線粒體膜的功能性,其下降是細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)[27]。本研究利用倒置熒光顯微鏡和流失細(xì)胞儀分析了南昆山毛葉茶水提物對tBHP誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞ROS產(chǎn)生及MMP變化的影響,結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖6 南昆山毛葉茶水提物對tBHP損傷NIH3T3細(xì)胞MMP的影響Fig.6 Effects of Camellia ptilophylla chang water extract on MMP by tBHP damage in NIH3T3 cells注:A:流式細(xì)胞儀中熒光強(qiáng)度分布;B:流式細(xì)胞儀中平均熒光強(qiáng)度;#代表tBHP組與對照組相比, *代表樣品組與tBHP組相比,#(*)有顯著差異,即P<0.05,##(**)有極顯著差異,即P<0.01。

由圖5的熒光顯微鏡定性觀察和流式細(xì)胞儀定量分析結(jié)果可知,與對照組相比,tBHP處理導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生,二者存在極顯著差異。與tBHP組相比,南昆山毛葉茶水提物處理組極顯著的降低ROS含量,且隨茶葉水提物濃度的增加,ROS的產(chǎn)生量降低,呈劑量依賴關(guān)系。MMP結(jié)果從圖6中可知,據(jù)圖6A所示,對照組97.41%的細(xì)胞呈紅色熒光,表明MMP和細(xì)胞狀態(tài)較正常。而tBHP處理組中78.26%細(xì)胞呈綠色熒光,即MMP下降,細(xì)胞處于凋亡早期。南昆山毛葉茶水提物處理的樣品組中,呈綠色熒光細(xì)胞的比例隨水提物濃度的提高而逐漸降低,呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)樣品濃度達(dá)到100 μg/mL時,呈綠色熒光細(xì)胞的比例降低至10.63%,表明MMP隨著水提物濃度的提高而增加,細(xì)胞中線粒體膜的損傷減少。由此說明,tBHP會導(dǎo)致MMP降低,細(xì)胞受損;而南昆山毛葉茶水提物隨著添加濃度的升高,MMP升高,顯示了其對NIH3T3細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)tBHP能誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷線粒體的軟骨膜,而導(dǎo)致MMP降低[28]。同時MMP也是線粒體通透轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore,MPTP)開放的表征,而ROS則可以誘導(dǎo)MPTP開放,同時也促進(jìn)自身線粒體產(chǎn)生ROS[27]。結(jié)合MMP和ROS結(jié)果可知,tBHP會導(dǎo)致NIH3T3細(xì)胞MMP降低,ROS含量增加,從而細(xì)胞受損;而南昆山毛葉茶水提物則會提高細(xì)胞MMP,降低ROS含量,減輕細(xì)胞受損程度,對細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。

2.7 NIH3T3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

caspase-3、caspase-9、細(xì)胞色素c均為凋亡蛋白,它們的活化程度越高及相對蛋白表達(dá)量升高,代表細(xì)胞發(fā)生凋亡[29-30]。為探究南昆山毛葉茶水提物對tBHP誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞氧化損傷機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法檢測caspase-3,caspase-9 蛋白活化程度,WB法檢測細(xì)胞色素c蛋白表達(dá),結(jié)果如圖7所示。

Caspases在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用,caspase-9可被線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放的細(xì)胞色素c激活,激活的caspase-9可引起caspase-3的活化,活化后的caspase-3能裂解相應(yīng)的底物,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29]。細(xì)胞色素c是一種高度保守的電子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,也是定位于線粒體膜間隙的呼吸鏈的一部分,它的釋放與MMP的下降有關(guān)[30-31]。由圖7A、7B可看出,tBHP處理組的caspase-9、caspase-3凋亡蛋白的活性顯著提高,而南昆山毛葉茶水提物處理的樣品組中的caspase-9、caspase-3蛋白活性相較于tBHP組顯著降低,并呈劑量依賴關(guān)系。圖7C、7D結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)tBHP處理組的細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),而南昆山毛葉茶水提物處理樣品組的表達(dá)顯著降低,并呈劑量依賴關(guān)系。綜上結(jié)果表明,tBHP通過活化caspase-3、caspase-9蛋白,增強(qiáng)細(xì)胞色素c表達(dá),導(dǎo)致NIH3T3細(xì)胞凋亡;而南昆山毛葉茶水提物則隨著添加濃度的升高,caspase-3、caspase-9的活化程度降低,細(xì)胞色素c表達(dá)降低,部分抑制NIH3T3細(xì)胞凋亡。說明南昆山毛葉茶水提物能部分抑制tBHP導(dǎo)致的NIH3T3細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建tBHP誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞氧化損傷模型,評估南昆山毛葉茶水提物的抗氧化活性,并對其抗氧化機(jī)理進(jìn)行初步探究。

南昆山毛葉茶水提物具有高可可堿、低咖啡堿,高GCG、低EGCG含量的特點(diǎn);tBHP能誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞氧化損傷,并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;南昆山毛葉茶水提物在25～100 μg/mL濃度范圍內(nèi),通過提高NIH3T3細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px抗氧化酶酶活力,提高GSH含量,降低MDA含量,阻止脂質(zhì)過氧化,減少ROS的積累,維持正常的MMP,同時減少細(xì)胞色素c的釋放,抑制caspase-9、caspase-3凋亡蛋白的表達(dá),抑制線粒體細(xì)胞凋亡途徑,從而有效減緩tBHP誘導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞的氧化損傷。