時羽杰,肖 徐,李晶晶,糜加軒,萬雪琴

(四川農(nóng)業(yè)大學林學院,四川成都 611130)

核桃(JuglansregiaL.)胡桃科核桃屬落葉喬木,與榛子、扁桃、腰果并稱世界四大干果,在我國有著悠久的栽培歷史,是優(yōu)良的果木兼用經(jīng)濟樹種[1-2]。核桃營養(yǎng)豐富,含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等[3-4],此外,還含有多酚類、糖類、黃酮類等功能物質(zhì)[5]。核桃仁是主要的食用和產(chǎn)品加工的部位,仁上有一層可以剝?nèi)サ姆N皮,即核桃的內(nèi)種皮,由于內(nèi)種皮富含多酚類物質(zhì)會使得蛋白質(zhì)沉淀,其中單寧類物質(zhì)會產(chǎn)生苦澀味,使得產(chǎn)品的口感和色澤受到影響[6-7]。因此,在生產(chǎn)加工中常將內(nèi)種皮作為核桃產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的廢棄物處理,造成了資源的嚴重浪費。

核桃中的多酚類物質(zhì)包括黃酮類和非黃酮類化合物,黃酮類主要為黃酮醇和黃烷醇,非黃酮類化合物主要包括水解單寧和酚酸[8]。黃酮類化合物具有較強的抗氧化作用,除此之外，還具有藥理作用,如抗腫瘤活性、抗癌、抗病毒、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗心腦血管病等功效,在食品、保健品、醫(yī)藥等方面應用十分廣泛[9-11]。但大量報道主要集中在核桃多酚類物質(zhì)整體性功能研究。Oliveira等[12]研究5個不同品種的核桃青皮多酚提取物的抗氧化作用和抗菌作用,發(fā)現(xiàn)多酚含量與抗氧化作用呈顯著正相關,且對金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用,最小抑菌濃度為0.1 mg/mL。張澤生等[13]研究核桃內(nèi)種皮多酚提取物對D-半乳糖致衰小鼠抗氧化能力的影響,發(fā)現(xiàn)多酚提取物可以顯著提高小鼠血清、肝臟和腦組織中的SOD、CAT、GSH-Px和T-AOC活力,并降低MDA含量。Carvalho等[14]研究核桃的多酚提取物抗氧化活性和對人類癌細胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)多酚提取物可以有效抑制腎臟癌細胞A-498和769-P的增殖,且核桃仁的總酚含量和抗氧化活性高于青皮和葉片。而對于核桃內(nèi)種皮多酚類物質(zhì)中的黃酮類化合物的抗氧化性和具體功能組分研究暫未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃 采摘于四川省崇州市四川農(nóng)業(yè)大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地CN-106無性系實驗林;蘆丁標準品 北京索萊寶科技有限公司提供;甲醇、乙醇、丙酮、抗壞血酸、鹽酸、鄰苯三酚、過氧化氫、硫酸亞鐵、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、Tris、水楊酸 分析純,四川萬科化學試劑公司。

SB25-12 DTDN型超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;Sorvall D-37520型離心機 美國科峻儀器公司;UV-1800型紫外可見光光度計 上海美譜達儀器公司;AR124CN電子分析天平 奧豪斯儀器上海有限公司;DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)世紀儀器有限公司;UPH超純水儀 四川優(yōu)普超純科技有限公司;CBM30A超高效液相色譜、4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)種皮黃酮的提取 成熟鮮核桃去除青皮后立即剝殼取仁,將種仁的內(nèi)種皮用鑷子撕下,置于研缽中用液氮快速研磨至粉末,準確稱取500 mg,加入溶劑后超聲提取,將超聲提取后的樣品溶液于離心機中10000 r/min離心5 min,取上清液于容量瓶中用相應溶劑定容至50 mL,再準確移取1.0 mL于10 mL容量瓶中用相應溶劑定容至刻度,作為樣品待測液備用。

1.2.2 內(nèi)種皮總黃酮得率測定 準確稱取蘆丁標準品20.0 mg,用60%的乙醇溶解,定容于100 mL容量瓶中,搖勻后作為標準溶液備用。用移液槍準確移取標準品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6個10 mL具塞試管中,用60%乙醇補足至5.0 mL,搖勻,按照采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法測定黃酮含量[15],于510 nm處測定黃酮的吸光度。以蘆丁標準溶液的濃度C(mg/mL)為橫坐標,吸光度值A為縱坐標,繪制得到回歸方程曲線y=11.011x+0.0111,相關系數(shù)R2=0.9948,呈良好的線性關系。

準確移取1.0 mL樣品溶液于10 mL具塞試管中,用60%乙醇補足至5.0 mL,搖勻,加入0.5 mL質(zhì)量濃度5% NaNO2,混勻靜置6 min,加入0.5 mL質(zhì)量濃度10% Al(NO3)3,混勻靜置6 min,加入4 mL質(zhì)量濃度4% NaOH溶液,靜置15 min后,在510 nm波長處測定樣品吸光度。根據(jù)蘆丁標準曲線計算黃酮得率,公式如下:

式中:W表示總黃酮得率,%;c表示總黃酮濃度,mg/mL;v表示提取液體積,mL;n表示稀釋倍數(shù);m表示內(nèi)種皮粉末質(zhì)量,mg。

1.2.3 單因素實驗設計 固定料液比1∶40 g/mL、提取溶劑濃度100%,提取溫度40 ℃、提取功率500 W、提取時間30 min,探究不同溶劑(水、甲醇、乙醇、丙酮)對黃酮得率的影響;固定乙醇為提取溶劑、料液比1∶40 g/mL、提取溫度40 ℃、提取功率500 W、提取時間30 min,探究乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、100%)對黃酮得率的影響;固定乙醇濃度60%、提取溫度40 ℃、提取功率500 W、提取時間30 min,探究不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)對黃酮得率的影響;固定提取溫度40 ℃、料液比1∶50 g/mL、乙醇濃度60%、提取功率500 W,探究不同提取時間(10、20、30、40、50 min)對黃酮得率的影響;固定料液比1∶50 g/mL、乙醇濃度60%、提取功率500 W、提取時間30 min,探究不同提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對黃酮得率的影響。

1.2.4 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上,選取三個對結(jié)果影響較大的因素,分別是乙醇濃度、料液比、提取溫度,以這三個因素為自變量(X),以黃酮得率為響應值(Y),采用Design-Expert 8.0.6軟件,依據(jù)Box-Behnken Design原理進行三因素三水平響應面實驗設計,對超聲提取條件進行優(yōu)化。實驗的因素與水平如表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 內(nèi)種皮黃酮抗氧化活性實驗 將多批次最佳工藝條件下提取的總黃酮溶液合并,60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到棕褐色固體,分別稱取一定量的總黃酮固體,用乙醇進行溶解并配制成不同濃度(10、20、30、40、50 μg/mL)的黃酮待測液,進行抗氧化活性實驗。

1.2.5.1 對羥基自由基(·OH)的清除作用 參考秦生華等[16]的測定方法并略作改動,取5支具塞試管,分別加入2 mL濃度為10、20、30、40、50 μg/mL的總黃酮待測液、2 mL 8 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、5 m L1.0% H2O2溶液,混勻后于室溫反應60 min,在510 nm處測定吸光度A,以超純水作為對照。固定上述試驗流程及條件,以超純水代替H2O2溶液并測定本底吸光度A1;以超純水代替黃酮待測液并測定空白吸光度A0;再以相同濃度的維生素C代替黃酮待測液,作為陽性對照。計算公式如下:

1.2.6 內(nèi)種皮黃酮類化合物鑒定 稱取濃縮后的黃酮固體100 mg,溶解于0.6 mL 70%甲醇提取液中,溶解后的樣品于4 ℃冰箱過夜,期間渦旋6次,以提高提取率。將黃酮提取液經(jīng)10000 r/min離心10 min,移取上清液,用0.22 μm的微孔濾膜過濾樣液,保存于進樣瓶中,共進行6次重復,并采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)分析。

液相條件:采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18(1.8 μm×2.1 mm×100 mm)色譜柱;流動相:水相(A)為超純水加入0.04%的乙酸,有機相(B)為乙腈加入0.04%的乙酸;洗脫梯度:0.00 min,B相比例為5%,10.00 min內(nèi)B相比例線性增加到95%,并維持在95% 1 min,11.00～11.10 min,B相比例降為5%,并以5%平衡至14 min;流速0.35 mL/min,柱溫40 ℃,進樣量4 μL。

質(zhì)譜條件為:電噴霧離子源(ESI)溫度550 ℃,質(zhì)譜電壓5500 V,簾氣(CUR)30 psi,碰撞誘導電離(CAD)參數(shù)設置為高。在三重四級桿(QQQ)中,每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)進行掃描檢測[18]。

利用軟件Analyst 1.6.3處理下機數(shù)據(jù),基于自建數(shù)據(jù)庫MVDB(metware database)及代謝信息公共數(shù)據(jù)庫,根據(jù)二級譜信息對內(nèi)種皮總黃酮提取物進行定性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均重復測定3次取平均值,利用Excel 2016和SPSS 26.0對單因素及抗氧化活性數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面實驗設計和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同溶劑對黃酮得率的影響 由圖1可知,當水作為溶劑時,黃酮的得率最低,為8.03%,而當乙醇和丙酮作為溶劑時,黃酮的得率較高分別是12.30%和12.43%,且無顯著性差異,但均顯著高于其他兩種溶劑(P<0.05)。考慮到乙醇試劑較為安全,且與丙酮的提取率差異不顯著,因此將乙醇確定為最佳的提取溶劑。

圖1 不同溶劑對黃酮得率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the yield of flavonoids注:不同小寫字母表示具有 顯著性差異(P<0.05);圖2～圖5同。

2.1.2 不同乙醇濃度對黃酮得率的影響 由圖2可知,乙醇濃度在40%～60%范圍內(nèi),黃酮得率隨著濃度的增大而增大,當乙醇濃度為60%時,黃酮得率達到最大值14.25%,且顯著高于其他濃度下的提取率(P<0.05);而后隨著濃度的增大,黃酮得率逐漸降低。其原因可能與黃酮的結(jié)構(gòu)和提取劑極性相關,黃酮為典型的有機化合物,易溶于乙醇等有機溶劑,因此一開始黃酮得率隨著乙醇濃度增大而增大[19]。而提取劑的極性會隨著體積分數(shù)的變化而變化,當乙醇濃度過高時,會把樣品中其余的醇溶性雜質(zhì)溶出,從而導致黃酮得率降低[20]。因此,將乙醇濃度設定為60%比較合適。

圖2 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.1.3 不同料液比對黃酮得率的影響 由圖3可知,隨著料液比的增大,黃酮得率逐漸增大,但當料液比為1∶50 g/mL時,黃酮得率達到最大值14.20%,且顯著高于其他料液比條件下的提取率(P<0.05),再隨著料液比的增大,黃酮得率反而降低。隨著料液比的增大,促進了核桃內(nèi)種皮粉末與溶劑之間的接觸,降低了黃酮類物質(zhì)向溶劑中溶出的阻力,使得總黃酮提取率增大[21],當料液比為1∶50 g/mL已經(jīng)將總黃酮全部溶出,再隨著料液比增大可能會使其他醇溶性雜質(zhì)析出,與黃酮分子競爭溶出空間導致得率下降[16]。因此,選擇1∶50 g/mL為最佳料液比。

圖3 料液比對黃酮得率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of flavonoids

2.1.4 不同提取時間對黃酮得率的影響 由圖4可知,隨著提取時間的增加,黃酮得率不斷增大,當提取時間為30 min時,黃酮得率為14.16%,再隨著提取時間的增加,黃酮得率趨于平穩(wěn)。說明黃酮含量一定,較長的提取時間使得黃酮已經(jīng)全部溶出,再延長提取時間只會造成時間、能源成分的增加,還易引入雜質(zhì)。因此,將提取時間設定為30 min較為合適。

圖4 提取時間對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

2.1.5 不同提取溫度對黃酮得率的影響 由圖5可知,提取溫度從30 ℃升高到40 ℃,黃酮得率迅速增加,當提取溫度為40 ℃時,黃酮得率達到最大值14.21%,當提取溫度在40～60 ℃,黃酮得率緩慢降低,但無顯著性變化(P>0.05)。當溫度為70 ℃時,黃酮得率又迅速下降。溫度升高,黃酮分子的運動活性增強,易擴散,得率增加。而在溫度為40～60 ℃時,得率降低,但無顯著性變化,可能是由于本試驗采用的是固定500 W的超聲功率,較大的功率使得黃酮在40 ℃、30 min條件下已被充分提取。當溫度過高時,黃酮類化合物結(jié)構(gòu)遭到破壞[22],得率迅速下降。因此,選擇40 ℃為最佳提取溫度。

圖5 提取溫度對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

2.2 響應面實驗結(jié)果與分析

2.2.1 回歸方程的建立 根據(jù)表1設計的因素和水平,以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)為自變量,核桃內(nèi)種皮黃酮得率(Y)為響應值,采用Box-Behnken實驗設計針對黃酮得率和三個因素進行響應面設計得到17個試驗點。實驗結(jié)果如表2所示。

對黃酮得率與乙醇濃度、料液比和提取溫度之間的關系進行回歸分析,得到回歸方程:Y=15.43-0.084A+0.24B+0.22C-0.020AB+0.0025AC-0.11BC-0.62A2-0.51B2-0.97C2,其中Y為黃酮得率的預測值。

2.2.2 回歸方程的檢驗 為了驗證回歸模型的有效性,對方程進行了方差分析檢驗,結(jié)果如表3。

表2 響應面實驗設計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

表3 回歸模型的方程分析Table 3 Equation analysis of regression model

根據(jù)F值大小可知,這三個因素對黃酮得率的影響主次順序為B(料液比)>C(提取溫度)>A(乙醇濃度)。其中因素B、C和二次項A2、B2、C2對核桃內(nèi)種皮黃酮類化合物得率有極顯著的影響(P<0.01),因素A、交互項BC對核桃內(nèi)種皮黃酮類化合物得率有顯著的影響(P<0.05)。

圖6 總黃酮提取效果的響應面分析圖Fig.6 Response surface of interactive effect on extraction of flavonoid

2.2.3 響應面分析 通過Design-Expert 8.0.6軟件,將AB、AC、BC交互作用進行分析,做出響應曲面圖和等高線圖。響應曲面的陡峭程度與該交互作用的顯著性成正比,曲面越陡峭,說明交互作用越顯著[24]。等高線的橢圓率也可以直觀地反應交互作用的強弱,等高線橢圓率越大,說明該交互作用越顯著[25-26]。由圖8可知,交互作用BC的響應曲面較陡峭,且其等高線圖橢圓率高,說明該影響因子對黃酮得率的交互作用顯著。圖6和圖7中響應曲面比較平滑,等高線趨近于圓形,說明交互作用AB、AC對黃酮得率的影響較小。

圖7 總黃酮提取效果的響應面分析圖Fig.7 Response surface of interactive effect on extraction of flavonoid

圖8 總黃酮提取效果的響應面分析圖Fig.8 Response surface of interactive effect on extraction of flavonoid

2.2.4 最佳條件的驗證 依據(jù)響應面模型和結(jié)果分析,得到核桃內(nèi)種皮總黃酮的最佳的提取工藝:乙醇濃度59.30%,料液比1∶52.21 g/mL,提取溫度40.99 ℃,在此條件下核桃內(nèi)種皮總黃酮的得率最高,可達15.47%。為方便試驗,將最佳工藝調(diào)整為乙醇濃度59%,料液比1∶52 g/mL,提取溫度41 ℃,超聲功率500 W,提取時間30 min,在此條件下進行3次重復試驗以驗證該工藝的可行性。結(jié)果表明,在此最佳工藝條件下,核桃內(nèi)種皮平均黃酮得率為15.58%,實際值和模型預測值相差0.11%,誤差率為0.71%,說明該模型可靠性較高,可以較好模擬核桃內(nèi)種皮黃酮的提取條件,且預測的黃酮得率準確,重復性較好。

2.3 核桃內(nèi)種皮黃酮體外抗氧化活性結(jié)果

圖9 黃酮對羥基自由基的清除能力Fig.9 Scavenging effect of flavonoids on ·OH

圖10 黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.10 Scavenging effect of flavonoids on

2.4 核桃內(nèi)種皮黃酮類化合物鑒定

通過UPLC-MS/MS平臺對核桃內(nèi)種皮總黃酮提取物進行檢測分析,結(jié)果如圖11a所示,6個重復樣本混合的總離子流的曲線重疊性高,即保留時間和峰強度均一致,說明質(zhì)譜對同一樣本不同時間檢測時,儀器信號穩(wěn)定。圖11b為6個重復樣本的多物質(zhì)提取的離子流譜圖,每一個峰代表檢測到的一個代謝物,且樣品組內(nèi)重復性較好。共檢測到561種代謝物,其中鑒定出黃酮類化合物119種,包括52種黃酮醇(胡桃苷、金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷、山柰酚、楊梅苷、楊梅素等),18種黃酮(木犀草素、蕓香柚皮苷、異高山黃芩素、麥黃酮、柚皮素-0-葡萄糖苷、芹菜素 5-O-葡萄糖苷等),18種黃烷醇類(沒食子酸、(-)-表沒食子兒茶素、(+)-沒食子兒茶素、兒茶素、原兒茶酸、表兒茶素等),8種二氫黃酮(圣草酚、柚皮素、松黃烷酮等),8種黃酮碳糖苷(牡荊素、葒草苷、金雀異黃素 8-C-葡萄糖苷等),5種花青素(芍藥花素、天竺葵素、飛燕草素 3-O-葡萄糖苷等),5種異黃酮(根皮苷、2′-羥基金雀異黃素、鳶尾苷等),3種二氫黃酮醇(香橙素、二氫槲皮素、短葉松素),2種查爾酮(柚皮素查爾酮和根皮素)。

圖11 樣品質(zhì)譜分析總離子流圖和代謝物檢測色譜圖Fig.11 Total ions current and metabolite detection chromatogram for mass spectrometry of samples

3 結(jié)論