姜垚如，牛蕾蕾，馮娜，范浩亮，靳茜茜，杜秋香，曹潔，王英元，孫俊紅

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；3.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?71199

肺栓塞（pulmonary embolism，PE）發(fā)病急、病死率高，嚴(yán)重威脅人類的健康與生命，通常繼發(fā)于下肢深靜脈血栓（lower extremity deep venous thrombosis，LEDVT）[1-2]。隨著下肢深靜脈血栓發(fā)病率的逐年上升，肺栓塞在法醫(yī)學(xué)鑒定中的出現(xiàn)率也呈逐年增高趨勢[3-4]。在法醫(yī)學(xué)鑒定中，深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）的檢驗、相關(guān)死亡原因及因果關(guān)系的鑒定已成為法醫(yī)病理學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點和難點問題[5-6]。有文獻(xiàn)[7-8]報道，下肢深靜脈血栓的遺傳率為0.11～0.83，提示遺傳因素在下肢深靜脈血栓發(fā)病過程中至關(guān)重要。本研究擬選取下肢深靜脈血栓患者及健康對照者為研究對象，通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)[9-12]，選取4 個凝血相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）基因位點［rs1799963（凝血因子V 基因Leiden）、rs6025（凝血酶原基因G20210A）、rs1042579（血栓調(diào)節(jié)蛋白基因c.1418C＞T）及rs1801131（亞甲基四氫葉酸還原酶基因）］，檢測其突變情況，結(jié)合年齡、性別及其他血液生物化學(xué)指標(biāo)研究下肢深靜脈血栓的危險因素，以期為深靜脈血栓形成的診斷提供分子遺傳學(xué)的評價指標(biāo)，也為肺栓塞的法醫(yī)病理學(xué)鑒定及死亡原因分析提供新的依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2014 年11 月—2015 年11 月在山西省人民醫(yī)院和山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院通過血管造影或多普勒確診下肢深靜脈血栓形成的病例作為病例組，共150 例，其中男性83 例、女性67 例，平均年齡（55.33±14.67）歲。

收集對照組153 例，其中男性137 例、女性16 例，平均年齡（41.76±9.37）歲，均來自山西大同煤業(yè)集團健康員工。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往無血栓栓塞癥、心腦血管病史、血液系統(tǒng)疾病、重要生命器官疾病及外傷史等。

參與本研究的303 名對象均為山西籍漢族，血樣采集的同時收集血常規(guī)、血液生物化學(xué)檢驗結(jié)果，記錄D-二聚體、纖維蛋白原、纖維蛋白原降解產(chǎn)物、同型半胱氨酸、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白8 項臨床指標(biāo)。本研究所有受試者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本的采集和保存

常規(guī)禁食12 h 后采集外周靜脈血5 mL 置于抗凝管中，于干冰中運送，取回實驗室后將血液標(biāo)本分裝于1.5mL離心管中，4℃冰箱中保存，1周內(nèi)提取DNA。

1.2.2 DNA的提取及濃度測定

根據(jù)QIAamp?DNA Mini and Blood Mini 試劑盒（德國Qiagen 公司）操作說明書提取病例組及對照組的DNA。采用Infinite M200 PRO NanoQuant 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）對所有樣本的DNA進(jìn)行濃度和純度測定，D260/D280值均達(dá)到1.6～1.8，方可進(jìn)行后續(xù)實驗[13]。

1.2.3 基因型測定

由Invitrogen 公司對rs1799963（凝血因子V 基因Leiden）、rs6025（凝血酶原基因G20210A）、rs1042579（血栓調(diào)節(jié)蛋白基因c.1418C＞T）及rs1801131（亞甲基四氫葉酸還原酶基因）4 個位點進(jìn)行引物合成，引物序列見表1。

表1 rs1799963、rs6025、rs1042579和rs1801131的引物序列Tab.1 Primer sequence of rs1799963，rs6025，rs1042579 and rs1801131

建立競爭性等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（kompetitive allele specific polymerase chain reaction，KASP）10 μL PCR 反應(yīng)體系[14]，體系構(gòu)成如下：KASP master mix 5 μL、KASP primer mix 0.54 μL，樣品質(zhì)量濃度在反應(yīng)體系需達(dá)到5 g/L，用ddH2O 將體系補足至10 μL。PCR 反應(yīng)在HydrocyclerTM水浴PCR 儀（英國LGC 公司）中進(jìn)行，用FLUOstar Omega 多功能酶標(biāo)儀（德國BMG Labtech 公司）進(jìn)行孔板熒光檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

基 于rs1799963、rs6025、rs1042579 和rs1801131各自的基因頻率及文獻(xiàn)[9-12]報道的比值比（odds ratio，OR），結(jié)合本研究的樣本量，最終計算得到其各自的統(tǒng)計效力，依次為78.8%、87.2%、96.9%、87.4%，可進(jìn)行后續(xù)分析。

采用SPSS 22.0 軟件（美國IBM 公司）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。由于下肢深靜脈血栓好發(fā)于40 歲以上人群[15]，故以40 歲為界將對照組和病例組劃分為40 歲以下組和40 歲以上組。血液生物化學(xué)指標(biāo)等資料首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，病例組與對照組均數(shù)之間的比較采用方差分析；不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用中位數(shù)±四分位距（M±QR）表示，并采用秩和檢驗進(jìn)行兩組之間的比較，再以臨床參考值為界限，采用χ2檢驗進(jìn)行兩組之間的比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。運用Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗樣本的群體代表性。將病例組與對照組中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的血液生物化學(xué)指標(biāo)、年齡、性別分別引入二元Logistic 回歸方程，得到下肢深靜脈血栓形成的獨立危險因素，并在校正這些混雜因素后，按檢驗水準(zhǔn)α=0.20，應(yīng)用錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）方法進(jìn)行多重比較，探討各基因在不同遺傳模式下（顯性遺傳、隱性遺傳、共顯性遺傳和加性遺傳4 種模式）[16]基因多態(tài)性與下肢深靜脈血栓形成的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析

D-二聚體、纖維蛋白原、纖維蛋白原降解產(chǎn)物、同型半胱氨酸、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白8 項指標(biāo)均不服從正態(tài)分布，經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗后，除甘油三酯、高密度脂蛋白在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余6 項指標(biāo)在兩組中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。對上述指標(biāo)進(jìn)行χ2檢驗，甘油三酯、高密度脂蛋白在兩組間的差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義，其余6 項指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，臨床資料信息見表2。

表2 病例組和對照組的臨床資料信息Tab.2 Clinical information of the case group and the control group （M±QR）

2.2 基因多態(tài)性與下肢深靜脈血栓形成的分析

2.2.1 凝血相關(guān)基因多態(tài)性檢測結(jié)果

通過KASP 基因分型技術(shù)檢測全部樣本基因型，經(jīng)χ2檢驗基因型分布頻率，本研究所收集樣本符合Hardy-Weinberg 平衡，說明樣本具有一定的群體代表性?；蛐头植碱l率見表3。

表3 病例組和對照組在4個SNP位點的基因型分布頻率Tab.3 Genotype distribution frequency of 4 SNP loci of the case group and the control group ［例（%）］

2.2.2 多因素二元Logistic回歸分析

以是否患有下肢深靜脈血栓作為因變量，以差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的血液生物化學(xué)指標(biāo)（D-二聚體、纖維蛋白原、纖維蛋白原降解產(chǎn)物、同型半胱氨酸、膽固醇、低密度脂蛋白）以及性別、年齡作為自變量分別引入二元Logistic 回歸模型中，結(jié)果提示有5 個變量可能是下肢深靜脈血栓形成的危險因素，結(jié)果如表4 所示。而其他血液生物化學(xué)指標(biāo)在Logistic 回歸模型中無意義，考慮可能與下肢深靜脈血栓形成無明顯相關(guān)性（P值均大于0.05）。

表4 Logistic回歸分析結(jié)果Tab.4 Results of logistic regression analysis

2.2.3 遺傳模式分析

對各基因在不同遺傳模式下的基因多態(tài)性與下肢深靜脈血栓形成之間的關(guān)系進(jìn)行分析。在校正了性別、年齡、D-二聚體、纖維蛋白原降解產(chǎn)物、同型半胱氨酸等因素后，發(fā)現(xiàn)rs1042579 的基因多態(tài)性在顯性遺傳模式下發(fā)揮作用，與下肢深靜脈血栓形成具有相關(guān)性：顯性遺傳模式下，rs1042579 的優(yōu)勢比為4.760，95%CI為1.457～15.550，P值 為0.010。rs1801131、rs1799963 在4 種遺傳模式下均未發(fā)現(xiàn)與下肢深靜脈血栓形成存在顯著相關(guān)性（P＞0.20）。由于rs6025 在病例組及對照組中僅存在野生型CC 基因型，故主要對rs1042579、rs1801131 以及rs1799963 進(jìn)行分析，3 種基因的遺傳模式對下肢深靜脈血栓的影響結(jié)果如表5 所示。

表5 3種基因在研究人群中的基因型遺傳模式Tab.5 Genotype inheritance patterns of 3 genes in research population

3 討論

靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）是一種發(fā)病急、致死率高的血管病，主要分為靜脈血栓形成和肺栓塞兩種類型，據(jù)文獻(xiàn)[17]報道，肺栓塞中約90%以上的栓子來自下肢深靜脈。據(jù)統(tǒng)計[18-19]，血栓栓塞致死約占法醫(yī)病理學(xué)鑒定案例死亡原因的5%。隨著法醫(yī)病理學(xué)檢驗技術(shù)的不斷發(fā)展，肺動脈主干的栓塞以及微小血栓造成大面積肺梗死引起的死亡一般較容易鑒別，但對于涉及外傷、自身遺傳因素在深靜脈血栓形成中的因果關(guān)系鑒定仍然是實際工作中的重點和難點。

下肢深靜脈血栓形成是指血液在深靜脈血管內(nèi)不正常凝結(jié)，阻塞管腔，導(dǎo)致靜脈回流障礙，其發(fā)病機制目前普遍認(rèn)同的是Virchow 的“三聯(lián)征”，即血流動力學(xué)變化、血管壁的損傷以及血液成分的改變[20]。年齡、性別、肥胖、創(chuàng)傷、妊娠、惡性腫瘤等因素通常為外在誘因，基因突變導(dǎo)致的遺傳性缺陷則是其形成的內(nèi)在原因。隨著研究的深入，凝血因子V 基因Leiden、亞甲基四氫葉酸還原酶基因、凝血酶原基因G20210A及血栓調(diào)節(jié)蛋白基因c.1418C＞T 的多態(tài)性與深靜脈血栓形成之間關(guān)系的研究已被國內(nèi)外學(xué)者探究報道[9-12，21-26]，凝血相關(guān)基因的多態(tài)性與下肢深靜脈血栓的關(guān)系備受關(guān)注，因此，本研究基于山西人群，選取了上述4 種凝血相關(guān)基因進(jìn)行研究。

rs1042579 突變使血栓蛋白調(diào)節(jié)基因編碼的丙氨酸被纈氨酸取代，血栓調(diào)節(jié)蛋白無法發(fā)揮其應(yīng)有的功能從而導(dǎo)致深靜脈血栓形成。按照SNP 與疾病遺傳關(guān)聯(lián)性研究中對遺傳模型的分析方法[27]，本研究分別對基因在顯性、隱性、共顯性、加性遺傳模式下對下肢深靜脈血栓形成風(fēng)險進(jìn)行了計算，結(jié)果表明，rs1042579 突變在顯性遺傳模式下可能是引起下肢深靜脈血栓形成的獨立風(fēng)險因素。

rs6025 突變，G20210A 編碼氨基酸的改變使凝血酶原異常增多導(dǎo)致血栓形成。對rs6025 突變的研究[9，23]結(jié)果顯示，其在深靜脈血栓形成患者中出現(xiàn)的頻率明顯高于正常人群，而本研究中無rs6025 突變個體，可能其并不是下肢深靜脈血栓形成的危險因素，這與國內(nèi)學(xué)者研究[25]結(jié)果一致。

rs1799963 突變使凝血因子V 基因Leiden 編碼的氨基酸改變，無法與活化蛋白C 結(jié)合，仍保持促凝血的活性。在本研究中，rs1799963 突變例數(shù)為1 例，遺傳模式的分析結(jié)果顯示位點突變與下肢深靜脈血栓形成無相關(guān)性，其不能作為下肢深靜脈血栓形成的獨立危險因素，考慮造成此種情況的原因可能與人種和地域差異有關(guān)。

rs1801131 突變使亞甲基四氫葉酸還原酶基因編碼的氨基酸改變，致四氫葉酸還原酶的活性與熱穩(wěn)定性降低，亞甲基四氫葉酸還原酶的缺陷導(dǎo)致同型半胱氨酸在血液中堆積，引起血管舒縮平衡紊亂，從而引發(fā)血栓形成。有研究[12，28]提示，亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成具有相關(guān)性，但本研究中rs1801131 突變在4 種遺傳模式下均未顯示出與下肢深靜脈血栓形成相關(guān)，其可能不是下肢深靜脈血栓形成的危險因素，分析該結(jié)果與國外學(xué)者研究結(jié)果不一致的原因，一方面可能是本研究樣本量不足，樣本代表性有差異，另一方面可能與不同國家或地域生活環(huán)境和地理條件差異以及種族間的遺傳變異有關(guān)。

除此之外，本研究通過χ2檢驗，發(fā)現(xiàn)D-二聚體、纖維蛋白原、纖維蛋白原降解產(chǎn)物、同型半胱氨酸、膽固醇及低密度脂蛋白在兩組中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，同時將年齡、性別引入二元Logistic 回歸模型，最終確認(rèn)D-二聚體、纖維蛋白原降解產(chǎn)物、同型半胱氨酸、年齡和性別可能為下肢深靜脈血栓形成的獨立危險因素。D-二聚體是纖溶過程的標(biāo)志物，當(dāng)機體存在高凝狀態(tài)、血管內(nèi)有活化的血栓形成和繼發(fā)性纖維蛋白溶解亢進(jìn)時，D-二聚體就會升高。纖維蛋白原降解產(chǎn)物能抑制纖維蛋白形成，有抗凝血酶作用，而升高的血漿同型半胱氨酸水平與深靜脈血栓形成關(guān)系密切[29-30]。

本研究仍存在一些不足，由于對照組樣本來自山西大同煤業(yè)集團健康員工，廠礦中女少男多，造成性別偏倚可能會對最終結(jié)果產(chǎn)生一定影響。因此，也將性別作為混雜因素列入多因素Logistic 回歸模型中，分析其與下肢深靜脈血栓形成的關(guān)系，在今后的研究中，將完善樣本的收集并進(jìn)一步探究。另外，基因多態(tài)性對下肢深靜脈血栓患病率的影響存在地域、種族性差異，許多遺傳變異與下肢深靜脈血栓形成的相關(guān)性尚未完全清楚，且深靜脈血栓形成可能涉及多個基因及多個位點，有時由于入選的研究對象存在地區(qū)和人種的差異，致基因多態(tài)性差異較大，研究結(jié)論也會不同。后續(xù)研究將不斷擴大樣本量，尋找更多與深靜脈血栓形成有關(guān)的SNP 位點。凝血相關(guān)基因的研究、確定、檢測對于臨床防治和相關(guān)死亡原因的法醫(yī)學(xué)鑒定具有深遠(yuǎn)意義，隨著更多研究的深入進(jìn)行，不僅對臨床準(zhǔn)確診斷并制定合理、有針對性的治療方案有一定幫助，對法醫(yī)學(xué)鑒定肺栓塞的發(fā)生及傷病關(guān)系鑒定也提供了新的思路和方法。