劉文喬，白銳，馬春玲，于峰，謝冰，董玫，哈婧，文迪

1.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院 河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室 河北省法醫(yī)分子鑒定協(xié)同創(chuàng)新中心 河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)鑒定中心，河北 石家莊 050017；2.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊050018

丁卡因（tetracaine）是一種高效的局部麻醉劑，相比其他麻醉劑具有起效快、作用持久、麻醉性能強等特點，多年來廣泛應(yīng)用于臨床[1-2]，然而，因藥物過量、吸收快或操作不當(dāng)誤入血管等引起的中毒、致死案件時有發(fā)生[3-5]。但是，丁卡因中毒的特征性病理變化少，且缺乏中毒數(shù)據(jù)庫，其相關(guān)案件的鑒定多數(shù)是通過排除其他死因后才能確定是否為中毒死亡。國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)實踐中，通常根據(jù)中毒者體液或者組織中丁卡因的含量來判斷其是否中毒或推斷死亡原因[6-8]，而對其誘導(dǎo)的代謝改變及其與潛在毒性機制的關(guān)系知之甚少。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，代謝物可反映細(xì)胞所處的環(huán)境，且與細(xì)胞的營養(yǎng)狀態(tài)、藥物和環(huán)境污染的作用以及其他外界因素的影響密切相關(guān)，被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、預(yù)后判斷、個體化治療及發(fā)病機制的研究[9]。本研究采用超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-high performance liquid chromatography-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Orbitrap HRMS）技術(shù)和代謝組學(xué)方法對丁卡因急性中毒致死相關(guān)代謝物的變化進(jìn)行觀測，結(jié)合模式識別方法，篩選出丁卡因急性中毒致死小鼠血清和組織中內(nèi)源性小分子生物標(biāo)志物，分析代謝通路變化規(guī)律，為丁卡因急性中毒的死因判定和毒性機制研究提供可靠的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

7～8 周雄性SPF 級ICR 小鼠40 只，體質(zhì)量（40±2）g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物許可證號為SCXK（遼）2015-0001。將小鼠飼養(yǎng)于室溫（23±2）℃、相對濕度（50±5）%、12 h∶12 h 光/暗循環(huán)的環(huán)境下，實驗前禁食不禁水12 h。

本實驗嚴(yán)格按照河北醫(yī)科大學(xué)動物倫理學(xué)委員會的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行操作。

1.1.2 主要儀器與試劑

UltiMateTM3000高效液相色譜儀串聯(lián)Q ExactiveTMFocus 質(zhì)譜儀、MicroCL 21R 微量離心機（美國Thermo Scientific 公司），ME204 電子分析天平（瑞士Mettler公司），LSETM渦旋振蕩器（美國Corning 公司），KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司），Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司），G50 組織研磨器［卡尤迪生物科技（北京）有限公司］。

丁卡因鹽酸鹽（北京百靈威科技有限公司），色譜純乙腈（美國Thermo Fisher Scientific 公司），色譜純甲酸（北京迪科馬科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及樣本收集

將40 只小鼠隨機分為對照組（20 只）和丁卡因急性中毒致死組（20 只）。急性中毒致死組小鼠給予50 mg/kg 丁卡因鹽酸鹽溶液腹腔注射，以呼吸心搏停止，角膜反射、疼痛反射、大血管搏動消失來判斷小鼠是否死亡。24 h 內(nèi)小鼠死亡表明急性丁卡因中毒死亡模型建立成功[7]，若小鼠在24 h 內(nèi)未死亡則排除于本實驗。

急性中毒致死組小鼠于死后立即進(jìn)行解剖，采集腹主動脈血于不添加抗凝劑的離心管中，在冰上凝固30 min，然后于4 ℃下以離心半徑8.5 cm，8 000 r/min，離心10 min，收集血清于離心管中并迅速在液氮中冷凍。取心臟、肝、肺、腦、腎和肌肉，所有組織均用去離子水沖洗以去除多余的血液，取出部分組織置于含10%中性甲醛溶液的離心管中用于組織病理學(xué)檢驗，剩余組織在濾紙上吸干，置于離心管，在液氮中淬滅。

對照組小鼠用等量生理鹽水腹腔注射，注射后0.5 h 頸椎脫臼處死，之后按照急性中毒致死組相同的程序和時間處理并提取血清和組織。

所有樣本置于-80 ℃保存。

1.2.2 組織病理學(xué)檢驗

將心臟、肝、肺、腦、腎和肌肉組織置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE 染色，在光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.3 樣本前處理

血清樣本處理：取100 μL 血清樣本，加入300 μL預(yù)冷的萃取溶劑（V乙腈∶V甲醇=1∶1），充分渦旋振蕩后超聲10 min，放入-20 ℃冰箱中靜置20 min，然后于4 ℃下以離心半徑8.5 cm，12 000 r/min，離心10 min。吸取上清液，微孔濾膜過濾后進(jìn)行UPLC-Orbitrap HRMS分析。

組織樣本（心臟、肝和腎）處理：將冷凍的組織樣本用研磨器研磨，稱取粉碎后的組織樣本約100 mg（濕質(zhì)量），迅速轉(zhuǎn)移至干冰預(yù)冷的離心管中，再放回干冰中，然后加入300 μL 預(yù)冷的純水，用組織研磨器充分勻漿，再加入300 μL 預(yù)冷的萃取溶劑（V乙腈∶V甲醇=1∶1），充分渦旋振蕩后超聲10 min，放入-20 ℃冰箱中靜置20 min，然后于4 ℃下以離心半徑8.5 cm，12 000 r/min，離心10 min。吸取上清液，微孔濾膜過濾后進(jìn)行UPLC-Orbitrap HRMS 分析。

質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本的制備：分別取每個處理完成的樣本10 μL 混合為QC 樣本，用于評價實驗過程中系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.2.4 UPLC-Orbitrap HRMS檢測

色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 m，美國Waters 公司），柱溫40 ℃，流速300 μL/min，進(jìn)樣量5 μL。流動相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈（B）。線性梯度洗脫程序：0～1 min，2% B；1～3 min，2%～15% B；3～6 min，15%～50% B；6～9 min，50%～95% B；9～12 min，95% B；12～12.01 min，95%～2% B；12.01～15 min，2% B。整個分析過程，樣品置于4 ℃自動進(jìn)樣器中。為避免儀器檢測信號波動造成的影響，采用隨機順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。樣本隊列中先連續(xù)設(shè)置5 個QC 樣本，然后每間隔10 個實驗樣本設(shè)置1 個QC 樣本，用于監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及數(shù)據(jù)的可靠性。

質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧電離（heated electrospray ionization，HESI）正負(fù)離子同時掃描模式進(jìn)行檢測。噴霧電壓2.5 kV，毛細(xì)管溫度250 ℃，加熱器溫度400 ℃，鞘氣、輔助氣體和吹掃氣體流速分別為50.0、13.0 和3.0 L/min。在Full MS/ddMS2掃描模式下進(jìn)行分析，掃描范圍（m/z）為80～1 200；一級質(zhì)譜掃描的分辨率設(shè)置為70 000，二級質(zhì)譜掃描的分辨率設(shè)置為17 500；歸一化碰撞能量（normalized collision energy，NCE）為12.5、25.0 和37.5 eV。

1.2.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.0 軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）中進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。使用空白樣本進(jìn)行背景扣除和噪聲去除，原始數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟：色譜峰提取、保留時間對齊、空值填充、基于QC 的峰面積校正和歸一化［變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜30%[10]］。被檢測到的最小峰值強度設(shè)置為1×106，質(zhì)量數(shù)匹配公差為5×10-6，強度公差為30%，信噪比（S/N）閾值為3，碎片首選加合離子設(shè)置為[M+H]+1、[M-H]-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將預(yù)處理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 軟件（瑞典Umetrics 公司）中進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。采用無監(jiān)督的多元統(tǒng)計分析方法主成分分析（principal component analysis，PCA）模型反映總體樣本的分布狀態(tài)、自然聚集以及異常樣本，通過QC 樣本的聚集度考察數(shù)據(jù)采集的質(zhì)量。采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）模型使組間區(qū)分最大化。多變量分析之前，對變量進(jìn)行對數(shù)變換和數(shù)據(jù)歸一化（通過Pareto scaling）。使用R2Y（表示解釋能力）和Q2Y（表示預(yù)測能力）這兩個指標(biāo)評價OPLS-DA 模型的擬合效果，指標(biāo)越接近1，表明OPLS-DA 模型數(shù)據(jù)擬合效果越好。可接受的Q2Y閾值應(yīng)該超過0.5[11]。進(jìn)行200 次置換檢驗來確定模型是否過擬合?；贠PLS-DA 還可對每個變量求一個變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值來選擇最重要的代謝物，并對VIP 值大于1.0 的代謝物進(jìn)一步分析。

在Compound Discoverer 3.0 軟件中做火山圖，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2 或FC≤0.5 以及t檢驗（檢驗水準(zhǔn)α=0.05）為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異代謝物。在本研究中，同時滿足VIP＞1、FC≥2 或FC≤0.5、P＜0.05 的化合物被認(rèn)為是差異代謝物。

通過與數(shù)據(jù)庫METLIN（http://metlin.scripps.edu）和HMDB（http://www.hmdb）的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖匹配準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)和片段信息，進(jìn)一步鑒定篩選出的差異代謝物，并應(yīng)用MetaboAnalyst 3.0 軟件（http://www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行代謝途徑分析，以富集分析（P＜0.05）和拓?fù)浞治觯╥mpact＞0.1）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步評估潛在的生物標(biāo)志物。以京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；https://www.genome.jp/kegg/）為參考依據(jù)，得到丁卡因急性中毒致死擾亂的主要代謝途徑。

2 結(jié)果

2.1 動物模型

丁卡因急性中毒致死組小鼠在腹腔注射丁卡因后1～5 min 即出現(xiàn)顫抖、步履蹣跚、全身抽搐、聳毛、不能直立等癥狀，稍后有流涎、驚厥、癱瘓和自殘行為，所有小鼠均在注射丁卡因后0.5 h 內(nèi)死亡，表明丁卡因急性中毒致死小鼠模型建立成功。對照組小鼠腹腔注射生理鹽水后，無明顯異常表現(xiàn)。

2.2 組織病理學(xué)改變

丁卡因急性中毒致死組小鼠肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，肝板結(jié)構(gòu)消失，空泡變性；心肌間質(zhì)水腫，間隙變寬；腎組織中可見腎小管淤血，血管擴張；肺、腦和肌肉組織內(nèi)未見明顯的改變。組織病理學(xué)改變見圖1。

圖1 丁卡因急性中毒致死小鼠的組織病理學(xué)改變（HE×400）Fig.1 Histopathological changes of mice died of acute tetracaine poisoning（HE×400）

2.3 代謝組學(xué)分析

對血清、肝、心臟和腎組織樣本進(jìn)行前處理后，用UPLC-Orbitrap HRMS 在正負(fù)離子同時掃描模式下進(jìn)行分析檢測。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果血清樣本中得到976 個變量，肝組織樣本中得到1 264 個變量，心臟樣本中得到875 個變量，腎組織樣本中得到1 074 個變量。PCA 得分圖（圖2）顯示：QC 樣本均表現(xiàn)出良好的聚集現(xiàn)象，說明該方法具有良好的重復(fù)性和系統(tǒng)穩(wěn)定性；對照組和丁卡因急性中毒致死組樣本均有明顯的分離趨勢，說明兩組樣本代謝物含量差異較大。

圖2 對照組和丁卡因急性中毒致死組小鼠血清和組織樣本以及QC樣本的PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of serum and tissue samples of mice in the control group，acute tetracaine poisoning death group and QC samples

2.4 差異代謝物的篩選與鑒定

為了篩選出與丁卡因急性中毒致死相關(guān)的差異代謝物，進(jìn)一步采用OPLS-DA 模型對丁卡因急性中毒致死組和對照組樣本進(jìn)行分析，兩組均有良好的區(qū)分，且聚類趨勢明顯（圖3）。兩組間OPLS-DA 模型的R2Y和Q2Y值均大于0.5 并接近1（表1）。

表1 血清和組織樣本的OPLS-DA模型參數(shù)Tab.1 OPLS-DA model parameters in serum and tissue samples

圖3 對照組和丁卡因急性中毒致死組小鼠血清和組織樣本的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots of serum and tissue samples of mice in the control group and acute tetracaine poisoning death group

為了進(jìn)一步驗證各OPLS-DA 模型的可靠性，采取200 次置換檢驗方法進(jìn)行評價，結(jié)果見圖4。經(jīng)置換檢驗得到的R2和Q2值均小于右側(cè)原點實際模型值，Q2回歸直線在y軸上的截距小于0，說明模型沒有過擬合?；贠PLS-DA 模型還對每個變量求出一個VIP 值，以VIP＞1 為篩選條件，找到重要的變量。再以FC≥2或FC≤0.5，P＜0.05為篩選條件，找到差異代謝物。

圖4 對照組和丁卡因急性中毒致死組血清和組織樣本OPLS-DA的200次置換檢驗結(jié)果Fig.4 Permutation test results（200 times）of OPLS-DA of serum and tissue samples in the control group and acute tetracaine poisoning death group

對篩選出的差異代謝物的精確分子質(zhì)量和二級碎片離子進(jìn)行在線數(shù)據(jù)庫匹配，鑒定結(jié)果見表2。血清樣本中鑒定出11 種差異代謝物，其中7 種上調(diào)，4 種下調(diào)；肝組織樣本中鑒定出25 種差異代謝物，其中17 種上調(diào)，8 種下調(diào)；心臟樣本中鑒定出12 種差異代謝物，其中7 種上調(diào)，5 種下調(diào)；腎組織樣本中鑒定出4 種差異代謝物，全部上調(diào)。

表2 血清和組織樣本中的差異代謝物Tab.2 Differential metabolites in serum and tissue samples

續(xù)表2Continued Tab.2

2.5 相關(guān)代謝途徑分析

將血清、腎、肝和心臟樣本中鑒定出來的差異代謝物用MetaboAnalyst 3.0 軟件進(jìn)行代謝通路分析，結(jié)果如圖5 所示。嘌呤代謝在血清、肝和心臟樣本代謝通路分析結(jié)果中均顯示受到顯著影響。肝組織樣本代謝通路分析結(jié)果顯示三羧酸循環(huán)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝也受到顯著影響（P＜0.05）。腎組織樣本代謝通路分析結(jié)果顯示某些受到干擾的代謝通路如花生四烯酸代謝的-lgP值與impact 值均較低，意味著這些途徑中變化的代謝物可能在丁卡因中毒中沒有起關(guān)鍵作用。丁卡因急性中毒致死擾亂的主要代謝途徑見圖6。

圖6 差異代謝物的顯著相關(guān)代謝通路示意圖Fig.6 Schematic diagram of significant related metabolic pathways of differential metabolites

圖5 對照組和丁卡因急性中毒致死組小鼠血清和組織樣本差異代謝物的代謝通路分析Fig.5 Metabolic pathway analysis of differential metabolites in serum and tissue samples of mice in the control group and acute tetracaine poisoning death group

3 討論

近年來，隨著美容整形行業(yè)的興起，局部麻醉劑的應(yīng)用逐漸增多，同時，所引起的中毒、致死案件頻繁發(fā)生。在這些中毒案件中，用藥過量或誤入血管是導(dǎo)致死亡的主要原因。在局麻藥中，丁卡因是常見的致死藥物之一，其使用方便，但缺乏安全管理措施。因此，本研究選擇丁卡因建立中毒小鼠死亡模型，通過預(yù)實驗確定了丁卡因單次腹腔注射的最小致死劑量為50 mg/kg。過量丁卡因被吸收進(jìn)入血液循環(huán)后，立即以較高的濃度到達(dá)腦和心臟，引起急性毒性反應(yīng)，如惡心、嘔吐、神色不安、眩暈、抽搐等[12-13]，本實驗觀察到的小鼠急性中毒癥狀與其一致。組織病理學(xué)檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除肝、心臟水腫以及腎淤血外，并無其他明顯的致死性改變。利用PCA 和OPLS-DA 對血清、肝、心臟和腎組織的實驗數(shù)據(jù)建立模式識別模型，經(jīng)置換檢驗?zāi)Ｐ臀催^擬合，說明模型可靠。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)研究方法之一，主要研究生物樣品中的低分子量內(nèi)源性代謝物[14]，是研究環(huán)境或內(nèi)源性因素引起的代謝表型變化的一種新興的組學(xué)方法，對于復(fù)雜系統(tǒng)的深入研究具有潛在的應(yīng)用優(yōu)勢[15-16]，近年來在法醫(yī)毒理學(xué)中的應(yīng)用已有較多報道[17]。目前，在小分子識別過程中主要應(yīng)用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜平臺，利用高分辨質(zhì)譜可以分析化合物的結(jié)構(gòu)信息，特別是生物體內(nèi)的代謝物。軌道離子阱質(zhì)譜儀具有較高的靈敏度和分辨率，在代謝組學(xué)研究中得到了很好的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用[18]。本研究通過UPLC-Orbitrap HRMS 的非靶向代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了一些與丁卡因急性中毒致死相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。

雖然多種代謝物在死亡后發(fā)生變化，但并非都與丁卡因急性中毒致死有關(guān)。一般根據(jù)OPLS-DA 模型的VIP 值選擇差異代謝物，VIP 值大于1 的代謝物被認(rèn)為是重要的變量[19]，然而，對于代謝物的選擇并沒有一個客觀的標(biāo)準(zhǔn)。為了在法醫(yī)學(xué)實踐中構(gòu)建一個快速的死因判定估計模型，理想的方法是使用較少但具有較高準(zhǔn)確性的代謝物。本研究以FC≥2 或FC≤0.5且P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選生物標(biāo)志物[20]。研究發(fā)現(xiàn)，這些代謝物在不同組織之間有很大的差異，表明每種組織中的代謝對丁卡因急性中毒有不同的反應(yīng)。但在組織間存在共同的差異代謝物，包括4-羥基苯甲酸、腺苷二磷酸核糖、腺苷酸琥珀酸、鳥嘌呤、鳥苷酸和腺苷酸（肝、心臟）；?；蛆Z去氧膽酸、二甲基乙醇胺（腎、肝、血清）；3-羥基丁酸、鄰氨基苯甲酸（血清、肝）；次黃嘌呤（肝、心臟、血清）；吲哚（腎、血清）。這表明不同組織中的代謝對丁卡因急性中毒致死反應(yīng)存在共同的特征。本研究還探討了與差異代謝物相關(guān)的代謝途徑，主要影響了嘌呤代謝，三羧酸循環(huán)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，揭示了主要受影響的代謝途徑與丁卡因急性中毒的關(guān)系。

有報道[21]稱，局麻藥的毒性機制可能是氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，但丁卡因的中毒機制目前尚未完全明確。三羧酸循環(huán)是所有需氧生物中通過將從蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物中提取的十六烷基-輔酶A 氧化成二氧化碳和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）而產(chǎn)生能量的一系列生化反應(yīng)[22-23]。同時，三羧酸循環(huán)提供某些氨基酸的前體作為其他生化反應(yīng)的物質(zhì)和細(xì)胞活動的可用化學(xué)能[24-26]，在許多生物學(xué)途徑中的中心作用表明其是碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝的樞紐。檸檬酸和琥珀酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。本研究中，在丁卡因中毒致死小鼠肝組織中，檸檬酸含量顯著增加，琥珀酸含量降低，提示三羧酸循環(huán)功能障礙，與文獻(xiàn)[21]報道一致。在真核細(xì)胞中，三羧酸循環(huán)是產(chǎn)生ATP 的主要途徑[27]。在本研究中，隨著中間產(chǎn)物檸檬酸、琥珀酸在三羧酸循環(huán)中濃度的改變，表明三羧酸循環(huán)代謝水平的降低以及隨后ATP 的產(chǎn)生和能量代謝的下降。由于過量使用丁卡因誘導(dǎo)的三羧酸循環(huán)受損導(dǎo)致ATP 產(chǎn)生不良，不僅影響細(xì)胞能量代謝，還影響其他需要足夠ATP 供應(yīng)的途徑。本研究結(jié)果顯示，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑的改變也可能是線粒體代謝紊亂的結(jié)果，因為參與能量代謝的代謝物也是上述許多途徑的重要中間產(chǎn)物。此外，有研究[28]結(jié)果表明，三羧酸循環(huán)的紊亂與藥物性肝損傷密切相關(guān)，本研究結(jié)果與其一致，說明丁卡因中毒可誘導(dǎo)肝毒性。同時，本研究組織病理學(xué)檢驗結(jié)果顯示肝細(xì)胞損傷也證明了這一點。

嘌呤是一組重要的細(xì)胞成分，在多種生物過程中起著重要的作用。在細(xì)胞增殖過程中，DNA 復(fù)制和RNA 生成為蛋白質(zhì)合成提供了支持，因此，有必要在細(xì)胞周期的不同階段增加核苷酸的合成[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性丁卡因中毒致死組小鼠在肝、心臟和血清中均鑒定出嘌呤代謝物，肝組織中嘌呤相關(guān)代謝物顯著增加，包括鳥苷酸、尿苷、腺苷、腺苷酸、腺苷酸基琥珀酸和次黃嘌呤，提示嘌呤代謝增強，意味著丁卡因急性中毒促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。次黃嘌呤可通過黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤，在單磷酸腺苷降解過程中，黃嘌呤是一種中間體，對于形成活性氧（reactive oxygen species，ROS）至關(guān)重要[30]。心臟中黃嘌呤上游代謝物鳥苷酸、鳥嘌呤、腺苷酸和腺苷酸基琥珀酸均增加，而次黃嘌呤降低，可能是由于黃嘌呤氧化酶的下調(diào)所致?？偟膩碚f，嘌呤代謝活動的增加導(dǎo)致ROS 形成，從而可能發(fā)生氧化應(yīng)激。血清中黃嘌呤和次黃嘌呤水平的降低，表明丁卡因急性中毒死亡的過程中氧化應(yīng)激可能得到了緩解。

本研究建立了代謝組學(xué)分析方法，篩選與丁卡因中毒相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，確定發(fā)生顯著變化的代謝通路。研究結(jié)果表明，該方法和模型在丁卡因中毒小鼠的死因判定研究中具有一定的潛力。本研究為藥物過量中毒死因判定提供了研究基礎(chǔ)，提示了運用該方法在實際檢案中進(jìn)行毒物中毒死因判定的可能性。