田甜，李雪榕，翟豪杰，張旭東，李明，劉敏

1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川 成都 610041；2.山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院，山西 太原 030001；3.黃南藏族自治州公安局，青海 黃南811399

皮膚切創(chuàng)是法醫(yī)學實踐中常見的損傷之一，研究發(fā)現(xiàn)磷酸化c-Jun 氨基端蛋白激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal protein kinase，p-JNK）[1]、肌成纖維細胞[2]等多種生化標志物均表現(xiàn)出與切創(chuàng)損傷時間相關(guān)的變化規(guī)律，但因為生化指標多呈波形改變，同一表達量可對應多個時間點，無法確定具體時間，且傷后短時間內(nèi)的組織形態(tài)學變化也無特異性，因此，切創(chuàng)的損傷時間推斷一直是法醫(yī)學實踐的難點及研究熱點。

代謝組學是應用現(xiàn)代分析方法對某一生物組織、細胞在一特定生理時期內(nèi)所有相對分子質(zhì)量低的代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析的一門新學科[3]，現(xiàn)已廣泛應用于藥物分析、疾病診斷等領(lǐng)域。柳丹鳳[4]發(fā)現(xiàn)燒死與不同原因死后焚尸的大鼠肝組織代謝物存在差異，代謝組學方法可用于燒死與死后焚尸的鑒別。田甜等[5-6]使用代謝組學方法檢測出電擊死與死后電擊大鼠血清、血漿的代謝產(chǎn)物均存在差異，該方法有望用于電擊死和死后電擊的鑒別。本研究擬建立大鼠皮膚切創(chuàng)模型，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)對切創(chuàng)后不同時間點的血清進行代謝組學檢測，應用正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squarediscriminant analysis，OPLS-DA）模型進行多元數(shù)據(jù)分析，篩選血清標志代謝物，建立標志代謝物含量變化與損傷時間之間的回歸模型，以期為切創(chuàng)損傷時間的推斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立

健康成年SPF 級SD 大鼠21 只，其中雌鼠9 只（體質(zhì)量219～225 g）、雄鼠12 只（體質(zhì)量325～411 g）。適應性飼養(yǎng)1 周后，將大鼠隨機分為對照組（3 只）和實驗組（18 只），實驗組再分為切創(chuàng)后1、2、4、8、16、24 h組，每組3 只。實驗前12 h 禁食禁水處理。所有大鼠均用乙醚麻醉。

麻醉生效后，實驗組大鼠于背部正中備皮，使用潔凈手術(shù)刀片縱向切割長度為3 cm 深達淺筋膜的皮膚全層創(chuàng)口；對照組大鼠麻醉后不做任何處理。

本實驗獲得四川大學動物倫理學委員會批準。

1.2 樣本采集及前處理

實驗組大鼠于傷后1、2、4、8、16、24 h 取股動脈血液1.5 mL。對照組大鼠于麻醉后直接取股動脈血液1.5 mL。血樣以離心半徑5.5 cm，3 000 r/min，離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中待檢。

1.3 樣本前處理

血清樣本：取血清10 μL 置于1.5 mL 離心管中，加入-20 ℃冰乙腈30 μL，渦旋2 min 后，在4 ℃下，以離心半徑10 cm，12 000 r/min，離心10 min，吸取20 μL上清液至杜氏小管中，氮吹儀吹干。加入10μL質(zhì)量濃度為15 mg/mL 的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液，密封渦旋2 min 后，置于16 ℃的黑暗環(huán)境中肟化16 h。肟化完成后迅速加10 μLN，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺［N，O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA］+1%三甲基氯硅烷（trimethyl chlorosilane，TMCS），密封渦旋2 min 后，置于70 ℃烘箱中硅烷化，1 h 后取出在黑暗環(huán)境中冷卻1 h。待冷卻至室溫后加入100 μL質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的硬脂酸甲酯庚烷溶液作為內(nèi)標，渦旋2 min 后靜置10 min，取上清液行GC-MS分析。

質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本：取各組血清各10 μL于5 mL離心管中離心混勻，獲得QC樣本。取10μL QC樣本于1.5mL離心管中，余操作同血清樣本。

空白樣本：取潔凈杜氏小管，加入-20 ℃冰乙腈30 μL，氮吹儀吹干，余操作同血清樣本。

1.4 GC-MS檢測

采用MA 等[7]報道的GC-MS 的檢測條件進行檢測，參數(shù)如下。

（1）色譜條件：DB-35ms 毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm；美國Agilent 公司），載氣為高純氦氣，流速1 mL/min，進樣口溫度250 ℃，輔助加熱器溫度230 ℃，分流比為10∶1；柱溫為起始溫度60 ℃，保持1 min，以8 ℃/min 升至300 ℃，保持5 min。

（2）質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；采用電子轟擊電離方式，電離能量70 eV，溶劑延遲4 min；采用全掃描模式監(jiān)測，全掃描范圍m/z50～600，掃描速度為2 spectra/s。

（3）進樣條件：自動進樣，每次進樣量為1 μL，進樣前用異丙醇清洗進樣針。

（4）進樣順序：按照1 針空白樣本、3 針QC 樣本、10 針血清樣本、1 針QC 樣本、11 針血清樣本、2 針QC樣本的順序完成進樣。

1.5 數(shù)據(jù)預處理

使用AMDIS 6.51 軟件（美國國家標準與技術(shù)研究院）對獲得的GC-MS 原始譜圖進行去卷積后，用NIST 2014 質(zhì)譜庫對各色譜峰（匹配度大于80%且峰面積大于10 000）進行定性，并與人類代謝組學數(shù)據(jù)庫（https://hmdb.ca/）比對，獲得代謝產(chǎn)物的名稱、保留時間和峰面積。再按接近的保留時間將色譜峰對齊、排列（保留時間偏差＜2%）。刪除血清樣本中保留時間一致的代謝物中峰面積大于空白樣本和QC 樣本的數(shù)據(jù)，以排除色譜峰噪聲。使用算術(shù)平均值填補空白，得到每一種代謝物的相對峰面積，即代謝物峰面積/本組內(nèi)標峰面積。

1.6 統(tǒng)計分析及標志代謝物篩選

使用SIMCA-P 14.1 軟件（瑞典Umetrics 公司）對數(shù)據(jù)進行OPLS、OPLS-DA 置換檢驗，得到R2、Q2值，R2表示模型的解釋能力，Q2表示模型的預測能力，R2、Q2終點越接近，同時Q2回歸直線與Y 軸有負截距，說明模型有效，無過度擬合現(xiàn)象，實驗組與對照組之間數(shù)據(jù)存在差異。OPLS-DA 模型驗證參數(shù)為R2X、R2Y、Q2。R2X為模型對自變量X數(shù)集上的解釋能力，R2Y為模型對因變量Y數(shù)集上的解釋能力，Q2表示模型的預測能力。當Q2＞0.4，且與R2Y差值不超過±0.3 時，認為模型有效，數(shù)據(jù)可靠[8]。

使用SIMCA-P 14.1 軟件對驗證成功的數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析。使用主成分分析（principal component analysis，PCA）對含QC 樣本的多組樣本進行識別分析，得出PCA 得分圖，QC 樣本聚集在小范圍內(nèi)表示儀器穩(wěn)定及代謝物數(shù)據(jù)可靠。使用OPLS-DA 的識別方法對各組樣本進行兩兩比對，篩選標志代謝物，得到所有變量的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP），選取VIP 值大于1.0 的變量，再通過SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析篩選出同時滿足VIP＞1.0 且P＜0.01 的損傷時間相關(guān)性標志代謝物。

最后對標志代謝物進行OPLS 分析，得到以預測損傷時間為自變量、實際損傷時間為因變量的線性回歸模型，獲得復相關(guān)系數(shù)（multiple correlation coefficient，R）。R值范圍為0～1，其值越接近1，線性回歸關(guān)系越密切，回歸模型建立越成功。

2 結(jié)果

2.1 QC樣本檢測結(jié)果

將實驗組樣本、空白樣本及QC樣本數(shù)據(jù)一起使用SIMCA-P 14.1軟件進行PCA分析，獲得得分圖（圖1），QC 樣本分布較為集中，說明系統(tǒng)誤差小，結(jié)果可靠。

圖1 所有樣本數(shù)據(jù)的PCA得分圖Fig.1 PCA score plot for all sample data

2.2 GC-MS譜圖

使用GC-MS 技術(shù)對各組樣本進行檢測，獲得代謝產(chǎn)物的原始色譜圖。比較不同損傷時間點的樣本色譜圖，發(fā)現(xiàn)各實驗組之間的色譜峰存在差異。

2.3 標志代謝物的初篩

選取得到色譜峰數(shù)量最多的QC 樣本進行物質(zhì)定性并作為峰對齊的參照標準。QC樣本共有197個色譜峰，將其逐一與NIST 2014質(zhì)譜庫比對，以匹配度＞80%為條件篩選出46 個色譜峰，結(jié)合人類代謝組學數(shù)據(jù)庫進一步匹配出21 種內(nèi)源性代謝物，包括有機酸類（乳酸、琥珀酸、壬酸、碳酸、三氯乙酸、軟脂酸、反式亞麻酸、11-亞油酸、硬脂酸、花生四烯酸），糖類（來蘇糖、甘露糖、阿洛糖、葡萄糖、半乳糖），醇類（甘油、肌醇、油酰二乙醇胺），以及甲酰胺、膽固醇、2，4-二叔丁基苯酚等。隨后對這21 種內(nèi)源性代謝物歸一化，獲得相對峰面積。

2.4 多元統(tǒng)計分析

2.4.1 模型驗證結(jié)果

經(jīng)SIMCA-P 14.1 軟件處理，所有實驗組樣本作為一個整體與對照組進行比較，在置換檢驗數(shù)量為200 的條件下，R2=0.386，Q2=-0.696，且兩者在終點趨于重合（圖2），提示模型驗證成功，無過度擬合現(xiàn)象，實驗組與對照組之間數(shù)據(jù)存在差異。各實驗組與對照組以及實驗組之間進行模式識別時，置換檢驗結(jié)果同樣提示模型驗證成功，各組之間數(shù)據(jù)存在差異，本實驗所得數(shù)據(jù)均可用于進一步分析。

圖2 實驗組與對照組OPLS-DA的200次置換檢驗結(jié)果Fig.2 Permutation test（200 times）results of OPLS-DA in the experimental group and the control group

2.4.2 多元統(tǒng)計分析結(jié)果

使用OPLS-DA 模式分別對各實驗組和對照組進行多元數(shù)據(jù)分析，傷后2 h 組與對照組相比，R2Y=1，Q2=1，說明獲得的數(shù)據(jù)可靠，模型對差異的識別能力強、預測能力好，并獲得得分圖（圖3），兩組數(shù)據(jù)能完全分開。其余各實驗組與對照組之間比較的結(jié)果與傷后2 h 組類似。

圖3 傷后2 h組和對照組OPLS-DA分析的得分圖Fig.3 Score plot of OPLS-DA analysis in the 2 h after injury group and the control group

對相鄰兩實驗組進行多元數(shù)據(jù)分析，傷后1 h 組與傷后2 h 組相比，R2Y=1，Q2=0.991，并獲得得分圖（圖4），兩組數(shù)據(jù)能完全分開。其余相鄰兩組之間的比較結(jié)果同傷后1 h 與傷后2 h 組比較結(jié)果類似。

圖4 傷后1 h組和傷后2 h組OPLS-DA分析的得分圖Fig.4 Score plot of OPLS-DA analysis in the 1 h after injury and the 2 h after injury group

對實驗組整體與對照組進行多元數(shù)據(jù)分析，R2Y=0.943，Q2=0.64，并獲得得分圖（圖5），實驗組內(nèi)各時間點數(shù)據(jù)能完全分開，說明各實驗組間數(shù)據(jù)存在差異，可用于后續(xù)分析。

圖5 實驗組和對照組OPLS-DA分析的得分圖Fig.5 Scores plot of OPLS-DA analysis in all experimental groups and the control group

2.5 標志代謝物篩選結(jié)果及隨損傷時間的變化

將篩選出的21 種標志代謝物數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析，結(jié)合VIP 值，通過單因素方差分析，最終獲得4 種標志代謝物，分別是膽固醇、2，4-二叔丁基苯酚、琥珀酸和甘油。

2，4-二叔丁基苯酚含量在傷后8 h 內(nèi)緩慢增加，8～16 h 迅速上升至最高值，16 h 后迅速下降，變化曲線呈平緩走行-快速上升-快速下降形態(tài)，其余標志代謝物含量無明顯變化（表1）。

表1 實驗組和對照組中4種標志代謝物的相對峰面積Tab.1 The relative peak area of 4 marker metabolites in each experimental group and the control group （n=3，）

表1 實驗組和對照組中4種標志代謝物的相對峰面積Tab.1 The relative peak area of 4 marker metabolites in each experimental group and the control group （n=3，）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05。

大鼠皮膚切創(chuàng)后，4 種標志代謝物含量隨損傷時間的推移發(fā)生一定變化，但各標志代謝物含量與損傷時間之間無明顯規(guī)律，利用4 種標志代謝物的含量變化情況無法直接推算損傷時間。

2.6 皮膚切創(chuàng)損傷時間推斷回歸模型的建立

2.6.1 4 種標志代謝物與皮膚切創(chuàng)損傷時間之間回歸模型的建立

將4 種標志代謝物的數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P 14.1 軟件，使用OPLS 模式進行處理，獲得回歸直線及回歸方程y=x-2.174×e8（e為自然常數(shù)，R2=0.704 9，圖6），說明血清中4 種標志代謝物的相對峰面積與損傷時間之間的關(guān)系較密切。應用該回歸方程對損傷時間進行預測，預測時間與損傷時間的差別波動較大（表2），損傷時間推斷準確性低。

圖6 使用OPLS模式得到的4種標志代謝物的回歸曲線Fig.6 Regression curve of 4 marker metabolites using OPLS model

表2 利用4種和21種標志代謝物的回歸曲線預測所得的損傷時間Tab.2 The wound age predicted using regression curves of 4 and 21 marker metabolites （n=3，，h）

表2 利用4種和21種標志代謝物的回歸曲線預測所得的損傷時間Tab.2 The wound age predicted using regression curves of 4 and 21 marker metabolites （n=3，，h）

2.6.2 21 種標志代謝物與皮膚切創(chuàng)損傷時間之間回歸模型的建立

將21 種標志代謝物的數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P 14.1軟件，使用OPLS 模式進行處理，獲得回歸直線及回歸方程y=x+2.858×e7（e為自然常數(shù)，R2=0.961 1，圖7），說明血清中21 種標志代謝物的相對峰面積與損傷時間之間的關(guān)系較密切。應用該回歸方程對損傷時間進行預測，發(fā)現(xiàn)預測時間與損傷時間的差別明顯減?。ū?），損傷時間推斷準確性有所提升，提示使用全部21 種標志代謝物所獲得的回歸模型對皮膚切創(chuàng)的損傷時間推斷準確性較高。

圖7 使用OPLS模式得到的21種標志代謝物的回歸曲線Fig.7 Regression curve of 21 marker metabolites using OPLS model

3 討論

3.1 GC-MS數(shù)據(jù)評價

GC-MS 作為代謝組學研究中常見的檢測手段之一，其性能已得到公認。但由于儀器每次運行時穩(wěn)定性及響應性不同、實驗人員操作水平不一等多種因素，會對代謝組學獲得的原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定影響，設置QC 樣本是對儀器穩(wěn)定情況及數(shù)據(jù)可靠程度進行監(jiān)測的最快捷有效的方法。QC 樣本由所有樣本等量混合后均分，其組分相同，于樣本前、樣本間、樣本后穿插進樣。所有數(shù)據(jù)進行PCA 分析后，QC 樣本在PCA得分圖上分布集中，代表QC 樣本經(jīng)GC-MS 檢測所獲得的數(shù)據(jù)差別微小，說明儀器穩(wěn)定性較好，實驗操作誤差等對實驗結(jié)果的影響較小，實驗數(shù)據(jù)可靠，可用于后續(xù)分析。

3.2 血清中4種標志代謝物的含量變化與損傷時間的關(guān)系

對于損傷時間的推斷，目前多采用免疫組織化學法[9-10]和Western 印跡法[11-12]，有學者嘗試通過檢測損傷后體內(nèi)mRNA[13-14]或DNA[15]的表達情況對損傷時間進行推測，但mRNA 和DNA 都存在易降解、穩(wěn)定性差的問題。研究結(jié)果表明，在皮膚切創(chuàng)后，隨著損傷時間的推移，機體在基因?qū)用鎇16]、蛋白層面[17]、組織微觀層面[16]都發(fā)生了不同程度的變化，這些變化最終都會導致體內(nèi)代謝產(chǎn)物發(fā)生改變。代謝組學正是通過分析機體內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化情況來反映機體當時的整體狀態(tài)[18]。近年來，代謝組學技術(shù)開始向法醫(yī)學科滲透，但目前應用較多的為法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域[19]。

國內(nèi)在法醫(yī)病理學領(lǐng)域應用代謝組學的研究目前才剛起步。魯翰霖[20]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠骨骼肌挫傷后出現(xiàn)了明顯的代謝差異，篩選出的5 種特征標志代謝物表現(xiàn)出與時間相關(guān)的表達規(guī)律，聯(lián)合受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線進行損傷時間推斷具有較高的準確性，本研究所得結(jié)果與其存在相似性。

本研究發(fā)現(xiàn)，由皮膚切創(chuàng)后血清中的代謝產(chǎn)物可獲得4 種標志代謝物（甘油、琥珀酸、2，4-二叔丁基苯酚、膽固醇）。盡管這4 種標志代謝物的含量均隨損傷時間延長而出現(xiàn)不同的變化規(guī)律，但這些變化規(guī)律與損傷時間無對應關(guān)系，推測可能與傷后局部應激反應和全身應激反應代謝產(chǎn)物入血的時間存在差異有關(guān)。因此，僅從本研究所得結(jié)果來看，無法直接使用這4 種標志代謝物的含量推斷損傷時間。

3.3 OPLS 回歸模型在皮膚切創(chuàng)損傷時間推斷中的應用評價

3.3.1 4種標志代謝物的OPLS回歸模型

使用OPLS 模式對4 種標志代謝物進行多組間統(tǒng)計分析，獲得了回歸模型，但用模型預測的損傷時間和實際損傷時間之間的差別較大，提示此模型的擬合度雖然較好，但準確性低，難以用于損傷時間推斷。

3.3.2 21種標志代謝物的OPLS回歸模型

使用OPLS 模式對21 種標志代謝物進行多組間統(tǒng)計分析，獲得了回歸模型，用模型預測的損傷時間和實際損傷時間之間的差別明顯減小，提示此模型的擬合度好，準確性大幅提升，故使用21 種標志代謝物的含量變化進行皮膚切創(chuàng)的損傷時間推斷更有價值。

綜上，本研究應用代謝組學方法，獲得4 種標志代謝物與21 種標志代謝物的數(shù)據(jù)，均可獲得OPLS回歸模型，但使用4 種標志代謝物的數(shù)據(jù)所建立的OPLS 回歸模型預測所得損傷時間的準確性遠不及21 種標志代謝物的數(shù)據(jù)所建立的OPLS 回歸模型。原因可能是，較多代謝物所得數(shù)據(jù)矩陣更大，在空間中的映射數(shù)量更多，有效相關(guān)性數(shù)據(jù)量更大，對結(jié)果的描繪也更為精確。本研究結(jié)果表明，代謝組學方法可以用于損傷時間推斷研究，但在后期研究中，建議設置大容量樣本，并選取盡量多的代謝物數(shù)據(jù)獲得預測更加準確的回歸模型，使皮膚切創(chuàng)損傷時間推斷的準確性進一步提升。