夏若成，張曉春，王笑笑，楊琪，陳沖，于歡，屈軼齡，王紫薇，施妍，向平，張素華，李成濤

1.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325235；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)系，江蘇 蘇州 215123；4.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；5.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710061

大麻（Cannabis sativaL.）是大麻科（Cannabaceae）大麻屬（Cannabis）一年生雌雄異株的草本植物，且大麻屬中只有大麻一個(gè)物種，主要分布于歐洲、非洲和亞洲的印度、尼泊爾、中國(guó)等地區(qū)，是地球上最古老的栽培作物之一[1]。大麻纖維是良好的紡織和造紙?jiān)?，植株?nèi)含有的四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，其種子富含人體易吸收的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸以及微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，已成為許多國(guó)家重要的經(jīng)濟(jì)作物。然而，由于大麻的花和葉中含有THC 這個(gè)具有強(qiáng)烈成癮性和麻醉性的致幻成分，已被聯(lián)合國(guó)禁毒公約列為與海洛因、可卡因并列的三大毒品之一[2]，大麻也是全球范圍內(nèi)種植、生產(chǎn)、販賣和吸食最廣泛的毒品。近年來(lái)，受到國(guó)際上一些國(guó)家和地區(qū)大麻合法化的影響，我國(guó)吸食和濫用大麻的人數(shù)持續(xù)上升，跨國(guó)販賣大麻案件日益增多。因此，如何對(duì)大麻進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的司法鑒定已然成為迫切的社會(huì)需求。

目前常規(guī)的大麻鑒定方法主要是進(jìn)行形態(tài)學(xué)和化學(xué)成分的分析。然而，在一些案件中，大麻經(jīng)過(guò)加工或與煙葉等混在一起，導(dǎo)致從形態(tài)上無(wú)法識(shí)別。對(duì)于大麻化學(xué)成分的分析，多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法檢測(cè)生物檢材中是否含有THC 并確定其含量，但GCMS 法分析大麻化學(xué)成分需要大量的樣本，且樣本必須是新鮮的，因?yàn)樵陉惻f樣本中THC 很容易被氧化[2]。此外，THC 的含量會(huì)受大麻植株的年齡、大小以及種植環(huán)境影響[3]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在DNA 水平上對(duì)物種進(jìn)行鑒定成為一種新的技術(shù)手段。DNA 條形碼技術(shù)是針對(duì)特定物種篩選出短而標(biāo)準(zhǔn)的DNA 片段作為標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化的物種鑒定[4]，該技術(shù)一經(jīng)提出就被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物及微生物的物種鑒定。rbcL 序列作為鑒定陸生植物的通用條形碼之一[5]，由編碼區(qū)與非編碼區(qū)組成，非編碼區(qū)具有高度保守序列，有助于通用引物的設(shè)計(jì)。同時(shí)，rbcL序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中擁有大量不同物種的數(shù)據(jù)，這使得檢測(cè)后的序列比對(duì)有據(jù)可依。FAZEKAS 等[6]采用4 對(duì)引物對(duì)251 個(gè)樣本進(jìn)行rbcL 全序列測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增及測(cè)序成功率可達(dá)100%，但rbcL 序列全長(zhǎng)約1 400 bp，實(shí)驗(yàn)繁瑣，數(shù)據(jù)分析工作量大，因此KRESS 等[7]建議選取rbcL 部分序列作為DNA 條形碼進(jìn)行物種鑒定。許貞等[8]基于rbcL 部分序列對(duì)天南星藥材及其常見(jiàn)混偽品進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，rbcL 部分序列可以對(duì)天南星及其混偽品快速、準(zhǔn)確地鑒別。

YANG 等[9]研究表明，大麻與葎草屬親緣關(guān)系最近，為評(píng)估rbcL 序列的鑒別能力，本研究收集了大麻及葎草屬（Humulus）植物樣本，擴(kuò)增并測(cè)定葉綠體DNA rbcL 序列中628～1 361 bp 片段[10]，對(duì)測(cè)定序列進(jìn)行BLAST 相似性檢索，并與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的大麻科植物的rbcL 序列進(jìn)行遺傳距離、中介網(wǎng)絡(luò)與系統(tǒng)聚類分析，旨在對(duì)rbcL 序列的檢測(cè)及鑒別性能進(jìn)行評(píng)估，判斷其是否適宜成為鑒定大麻的遺傳標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 樣本

檢測(cè)樣本：本研究共收集來(lái)自62 份大麻、10 份啤酒花（Humulus lupulus）、10份葎草（Humulus scandens）的葉片組織。其中大麻樣本（編號(hào)為DM001～DM062）由司法鑒定科學(xué)研究院法醫(yī)毒物化學(xué)研究室提供，經(jīng)GC-MS 法檢測(cè)為大麻；葎草屬的2 個(gè)物種啤酒花（編號(hào)為HL01～HL10）和葎草（編號(hào)為HS01～HS10）分別購(gòu)自新疆和安徽。

數(shù)據(jù)樣本：從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載大麻科10 個(gè)屬[9]48 個(gè)物種的rbcL 序列，每個(gè)物種選擇1～4 條序列，共篩選出96 條序列（附表1）。為了比較不同地區(qū)大麻rbcL 序列間的差異，從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載6 條產(chǎn)自不同地區(qū)的大麻rbcL 序列（JN040400、JN040401、AJ390068、AJ402933、AF500344、KF250351）。

1.2 DNA提取與定量

針對(duì)檢測(cè)樣本，取30 mg 風(fēng)干葉片組織，用75%乙醇溶液和超純水洗滌數(shù)次，加入液氮充分研磨后，采用DNeasy Plant Pro 試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）進(jìn)行DNA 提取，具體步驟參照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，并用Epoch 超微量微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)BioTek 公司）測(cè)定DNA 的純度及濃度。

1.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

采用rbcL 序列通用引物[9]進(jìn)行DNA 擴(kuò)增，其中正向引物序列為：5′-CCATTYATGCGTTGGAGAGA TCG-3′；反向引物序列為：5′-TCAGGACTCCACTTA CTAGCTTCACG-3′。構(gòu)建及優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)體系為15 μL，包含：2×Multiplex PCR Master Mix 7.5 μL，5×Q-Solution 1.5 μL，去離子水4 μL，正、反向引物混合物（10 μmol/L）1 μL，模板DNA（1 ng/μL）1 μL。PCR 反應(yīng)在9700 型PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）上進(jìn)行，優(yōu)化后的PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變 性30 s，53 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共30 個(gè)循環(huán)；60 ℃終延伸60 min。PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，選取在預(yù)期位置上出現(xiàn)的單一、清晰、明亮、無(wú)拖尾的條帶，純化回收后將測(cè)序產(chǎn)物在3730xlDNA 測(cè)序儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）上進(jìn)行雙向Sanger 測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DNAMAN v6.0 軟件（美國(guó)Lynnon Biosoft 公司）及Chromas Lite v2.01 軟件（澳大利亞Technelysium 公司）對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，獲得rbcL序列信息?；贜CBI中BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行核酸序列相似性檢索，采用MEGA X 在線軟件（https://www.megasoftware.net/）進(jìn)行序列比對(duì)及變異位點(diǎn)分析，對(duì)大麻科96 條序列進(jìn)行多重比對(duì)，同時(shí)基于Kimura-2-Parameter（K2P）模型計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離，運(yùn)用中介鄰接網(wǎng)絡(luò)（median-joining network，MJ）法構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖，并基于鄰接法（neighbourjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)，同時(shí)以bootstrap（自展支持率1 000 次）重復(fù)檢驗(yàn)各分支的支持率。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以DNA Ladder 2000（中國(guó)Novoprotein 公司）為分子量標(biāo)準(zhǔn)，82 份樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均在500～750 bp，且條帶單一、清晰、明亮、無(wú)拖尾，表明82 份樣本的rbcL 序列擴(kuò)增成功率為100%。

2.2 大麻序列分析

2.2.1 BLAST比對(duì)

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger 測(cè)序，62 份大麻樣本測(cè)序所得序列長(zhǎng)度均為617 bp，僅在90 bp 處發(fā)現(xiàn)一個(gè)單一多態(tài)性變異位點(diǎn)。20 份葎草屬樣本測(cè)序所得序列長(zhǎng)度均為649 bp，其中10 份啤酒花rbcL 序列完全一致，無(wú)變異位點(diǎn)；10 份葎草rbcL 序列也完全一致，無(wú)變異位點(diǎn)。

將測(cè)序所得的大麻rbcL 序列進(jìn)行BLAST 相似性檢索，與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中大麻的rbcL 序列（MH118118、KY419963、JN040400、MW013540、KY084475、KT458035、KR779995、KR184827、NC_027223和NC_026562）相似性為100%。啤酒花和葎草樣本的BLAST 檢索結(jié)果顯示其屬于葎草屬，其中測(cè)序所得的啤酒花rbcL 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中啤酒花的rbcL序列（MG573060、KT266264、KM360825）相似性為100%，測(cè)序所得的葎草rbcL 序列與Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中葎草的rbcL 序列（KC539684）相似性為100%。結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)rbcL 序列進(jìn)行BLAST 相似性分析可以初步鑒定大麻及葎草屬樣本。

2.2.2 變異位點(diǎn)分析

62 例大麻樣本測(cè)序所得rbcL 序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的6 條產(chǎn)自不同地區(qū)的大麻rbcL 序列（JN040400、JN040401、AJ390068、AJ402933、AF500344、KF250351）進(jìn)行比對(duì)，共發(fā)現(xiàn)2 個(gè)單一多態(tài)性變異位點(diǎn)（分別在90 bp 和350 bp 處）。由于葉綠體DNA 常被看作是獨(dú)立的遺傳單位，在細(xì)胞分裂時(shí)很少發(fā)生重組[11]，因此根據(jù)這2 個(gè)變異位點(diǎn)劃分了3 種單倍型，分別命名為Haplotype A（HA）型、Haplotype B（HB）型和Haplotype C（HC）型（表1）。本研究大麻樣本中共檢測(cè)到2 種單倍型，其中HA 型57 例（91.94%），HB 型5 例（8.06%），未檢測(cè)到HC 型。下載的6 條序列中，源自中國(guó)的大麻樣本為HB 型，英國(guó)和美國(guó)的大麻樣本均為HC 型，巴西的大麻樣本為HA 型。

表1 大麻變異位點(diǎn)與單倍型Tab.1 Variation sites and haplotypes of Cannabis sativa L.

2.3 大麻與大麻科其他物種間的序列分析

2.3.1 遺傳距離分析

通過(guò)對(duì)62 份大麻樣本測(cè)序所得序列和從Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的大麻科96 條序列進(jìn)行分析，并使用MEGA X 軟件選擇K2P 模型計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離。結(jié)果（附表2）顯示，大麻種內(nèi)不同樣本的遺傳距離為0～0.004 9，而大麻與其他92 個(gè)非大麻物種之間的最小遺傳距離為0.012 9（大麻與啤酒花），即大麻的最小種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離。此外，屬間遺傳距離（表2）顯示，大麻屬與葎草屬的遺傳距離最小，為0.016 7，表明與其親緣關(guān)系最近。

表2 大麻科屬間的K2P遺傳距離Tab.2 K2P genetic distance between genera of Cannabaceae

2.3.2 中介網(wǎng)絡(luò)分析

基于大麻科不同物種間的堿基變異位點(diǎn)，本研究運(yùn)用中介鄰接網(wǎng)絡(luò)法構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖，用于顯示序列信息并評(píng)估rbcL 序列鑒別大麻的能力。由圖1 可以看出，大麻可以很好地與其他大麻科物種進(jìn)行分離，包括與大麻親緣關(guān)系最近的葎草屬，且大麻樣本也明顯地分為3 個(gè)小群，這與變異位點(diǎn)分析中將不同大麻樣本劃分為3 種單倍型（HA 型、HB 型和HC 型）的結(jié)果相吻合。

2.3.3 系統(tǒng)聚類樹(shù)分析

基于大麻科96 條rbcL 序列，通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)。如圖2 所示，構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹(shù)主要分為7 支，大麻與葎草屬聚為一支，在該分支中大麻與葎草屬各自聚成一個(gè)單系群（bootstrap 99%），表明盡管大麻與葎草屬親緣關(guān)系最近，但rbcL 序列能夠?qū)⒋舐榕c葎草屬進(jìn)行有效區(qū)分。上述結(jié)果表明，rbcL 序列可用于大麻及其他大麻科物種間的鑒別。

圖2 基于rbcL序列構(gòu)建的大麻科系統(tǒng)聚類樹(shù)Fig.2 System clustering tree of Cannabaceae based on rbcL sequence

3 討論

目前，大麻常規(guī)的鑒定方法為利用GC-MS 法檢測(cè)植株內(nèi)THC 含量是否高于0.5%[12]。然而，大麻植株在不同的發(fā)育階段及受到光照時(shí)間、環(huán)境溫度、土壤濕度等環(huán)境因子的影響，其植株內(nèi)的THC 含量會(huì)發(fā)生改變[13]，并且THC 在陳舊樣本中很容易被氧化導(dǎo)致THC 含量降低，這些因素增加了利用GC-MS 法對(duì)大麻進(jìn)行成功鑒定的困難。DNA 條形碼技術(shù)作為一種新的分子鑒定技術(shù)，與傳統(tǒng)的物種鑒定方法相比，具有準(zhǔn)確性高、效率高以及不受環(huán)境、個(gè)體發(fā)育和人為因素影響等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物以及微生物的物種鑒定。宋炳軻等[14-15]利用psbA-trnH 和ITS2序列對(duì)大麻及其混偽品進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示，psbAtrnH 和ITS2 序列可以準(zhǔn)確地鑒別大麻及其混偽品。

目前業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)為rbcL 序列相比于其他條形碼具有易于擴(kuò)增及測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)[16]，適用于物種鑒定，而國(guó)內(nèi)對(duì)于大麻rbcL序列的研究較少。本研究設(shè)計(jì)的檢測(cè)體系可對(duì)大麻及葎草屬樣本中rbcL序列進(jìn)行成功擴(kuò)增。將測(cè)序獲得的大麻rbcL 序列進(jìn)行BLAST 相似性檢索，結(jié)果顯示，本研究中的大麻測(cè)序數(shù)據(jù)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的部分大麻的rbcL 序列相似性高達(dá)100%，可初步確定62 份實(shí)驗(yàn)檢材均為大麻樣本。

本研究從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選了96 條大麻科rbcL 序列（來(lái)自10 個(gè)屬48 個(gè)物種），其中的4 條大麻rbcL 序列包含了2.2.2 節(jié)所述3 種單倍型。對(duì)96 條大麻科rbcL 序列進(jìn)行遺傳距離分析，結(jié)果顯示，大麻種內(nèi)不同樣本間最大遺傳距離為0.004 9，小于大麻與非大麻物種之間的最小遺傳距離（0.012 9，出現(xiàn)在大麻與啤酒花之間），表明rbcL 序列有足夠的序列差異性來(lái)區(qū)分大麻與大麻科其他物種，證明了rbcL 序列鑒別大麻及其近緣物種的可行性。中介網(wǎng)絡(luò)分析也顯示了相同的結(jié)果?；谙到y(tǒng)聚類樹(shù)的分析顯示大麻與葎草屬聚為一支，表明大麻與葎草屬親緣關(guān)系最近，這與2.3.1 節(jié)中大麻與葎草屬的遺傳距離最小相吻合。盡管大麻與葎草屬親緣關(guān)系最近，系統(tǒng)聚類樹(shù)結(jié)果顯示rbcL 序列仍然可以準(zhǔn)確地將大麻與葎草屬區(qū)分開(kāi)，這為在實(shí)踐中依據(jù)rbcL 序列區(qū)分大麻與葎草屬提供了可能。

此外，本研究對(duì)產(chǎn)自中國(guó)、英國(guó)、美國(guó)和巴西4 個(gè)地區(qū)的大麻樣本進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)在2 個(gè)位置上出現(xiàn)了單一多態(tài)性變異位點(diǎn)，總計(jì)3 種單倍型，其中源自中國(guó)的大麻單倍型為HA 型和HB 型，英國(guó)與美國(guó)大麻具有相同的單倍型HC 型，巴西大麻單倍型為HA 型，進(jìn)一步研究大麻產(chǎn)地與單倍型之間的關(guān)系將有助于跨國(guó)販毒案件的追蹤與調(diào)查。

綜上所述，本研究基于rbcL序列對(duì)大麻進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，基于rbcL 序列所構(gòu)建的BLAST 相似性檢索聯(lián)合系統(tǒng)聚類樹(shù)法，可為法醫(yī)學(xué)大麻種屬鑒定提供一種可靠、便捷的檢測(cè)手段，有助于警方打擊販毒集團(tuán)及個(gè)人。rbcL 序列可以作為鑒定大麻的DNA 條形碼，今后仍需要收集更多地區(qū)的大麻進(jìn)行研究，擴(kuò)充數(shù)據(jù)庫(kù)，使不同地區(qū)販毒案件的毒源追蹤成為可能。