李國萃,陸佳涵,盧秋翰,楊晨波,叢 喆,魏 強

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室,北京 100021)

在許多免疫系統(tǒng)疾病的研究中,T 細胞激活和增殖程度可以反應(yīng)疾病的進展?fàn)顩r。 通常將PBMC(外周血單個核細胞)作為靶細胞來研究細胞因子的分泌和表面活化標(biāo)志物及增殖標(biāo)志物的表達等。常用的 T 細胞刺激劑為 PMA+Ionomycin、α-CD2/α-CD3/α-CD28、PHA-P+IL-2 等。 T 細胞接受活化信號后,檢測活化分子的表達是一種常規(guī)手段。 CD69分子是自然殺傷細胞受體家族的C 型凝集素,T 淋巴細胞被活化后,CD69 迅速被誘導(dǎo)表達,而且在短時間內(nèi)很快便能達到高峰,因此CD69 被用作淋巴細胞活化的早期標(biāo)志物[1-2]。 CD38 分子常作為一種用于診斷臨床疾病的指標(biāo),同時也是T 細胞晚期活化標(biāo)記物[3-4]。 HLA-DR 分子是MHC-II 類分子,主要起著抗原呈遞的作用,也是T 細胞活化的常用標(biāo)志物。 Ki67 常作為T 細胞增殖標(biāo)記。 本研究擬通過流式細胞術(shù)檢測T 細胞活化分子來比較幾種不同T 細胞刺激劑的活化效果,以期為T 細胞激活相關(guān)研究選擇合適的刺激劑奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

3 只 SPF 級中國恒河猴,1 只雌性,2 只雄性,年齡為3～6 歲,體重約7 ～8 kg,均購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所[SCXK(京) 2015-0011]。 實驗前通過免疫熒光法篩查,排除猴皰疹病毒,猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒,猴免疫缺陷病毒及猴T 淋巴細胞性I 型病毒。 實驗動物的飼養(yǎng)及實驗操作在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所生物安全三級實驗室進行[SYXK(京) 2017-0027]。 實驗進程遵循3R 原則。本實驗使用的實驗動物程序通過了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)的批準(zhǔn)(XJ19003)。

1.1.2 實驗細胞

外周血單核細胞來源于健康恒河猴。

1.2 主要試劑與儀器

T 細胞刺激劑:Cell Stimulation Cocktail(Cat.No:00 - 4975 - 73) 購自 eBioscience 公 司; T Cell Activation/ Expansion Kit non-human primate(Cat.No:130-092-919)購自Miltenyi biotec 公司;PHA-P(Cat.No: L1668)購自 SIGMA 公司;IL-2(Cat.No:202-IL)購自R&D 公司[5-8];流式實驗所用試劑為fixation/permeabilization concentrate (Cat. No: 00 -5123-43)、fixation/permeabilization diluent(Cat.No:00-5223-56)和 permeabilization Buffer 10×(Cat.No:00-8333-56) 購自 ebioscience 公司。 流式染色方案見表1。

流式儀:檢測T 細胞表面活化標(biāo)志物所用流式儀:型號為BD FACSAria II,產(chǎn)地為美國;檢測T 細胞核內(nèi) Ki67 抗原所用流式儀:型號為 BD Accuri C6, 產(chǎn)地為美國;顯微鏡:型號為Nikon ECLIPSE Tiu, 產(chǎn)地為日本。

表1 抗體一覽表Table 1 List of antibodies

1.3 實驗方法

1.3.1 PBMC 的分離

采集健康恒河猴的外周血[9],離心后棄去上層血漿,加入與全血相等體積的1640 培養(yǎng)基進行稀釋,吹打混勻,將稀釋后的全血加入裝有Ficoll 液體的離心管中,離心后吸取中間PBMC 細胞層至新的離心管中,加入1640 培養(yǎng)基進行洗滌,離心后棄去上清液體,輕輕彈起管底細胞團塊,用1640 培養(yǎng)基重懸至所需要的濃度,進行后續(xù)的實驗。

1.3.2 T 細胞刺激劑刺激PBMC

(1) 用 PMA + Ionomycin/PHA-P + IL-2 刺激PBMC

分離好PBMC 后[10],用含有10%FBS 和2%雙抗的完全培養(yǎng)基重懸細胞,分裝到48 孔板中,細胞濃度 為 每 孔 1 × 106mL, 每 孔 加 入 2 μL Cell Stimulation Cocktail/4 μg/mL 的 PHA-P 和 20 ng/mL的IL-2,用槍頭吹打混勻,放入37℃,5%CO2孵箱中進行培養(yǎng)。 在不同時間點收取細胞,進行后續(xù)的流式實驗。

(2) 用T Cell Activation/ Expansion Kit nonhuman primate 刺激 PBMC

取出裝載好抗體的磁珠(抗體終濃度為10 μg/mL),加入含10%FBS 的X-VIVO 15TM培養(yǎng)基,離心后重懸備用。 同時將PBMC 用上述培養(yǎng)基重懸,并與重懸備用的磁珠混合均勻。 加入48 孔板中,細胞濃度為每孔1×106mL,37℃,5% CO2培養(yǎng)箱孵育,在不同時間點收集細胞,進行后續(xù)實驗。

1.3.3 流式方法檢測T 細胞表面活化標(biāo)志物。

將孔板中的細胞懸液加入流式管中,同時加入CD3-BV605、 CD8-PE、 CD4-BV785、 CD69-BV421、CD38-FITC 和 HLA-DR-BV510,4℃下放置30 min,1%多聚甲醛溶液固定,最后上機檢測染色情況[11]。

1.3.4 流式方法檢測T 細胞核內(nèi)Ki67 抗原

將孔板中的細胞懸液加入流式管中[12],并加入CD3-PerCP、CD4-APC 和 CD8-PE,4℃ 放置 30 min。隨即加入配制好的固定/破膜液作用30 min。 加入Ki67-FITC 抗體,室溫避光30 min,1%多聚甲醛溶液固定,上機檢測分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

流式數(shù)據(jù)用 FlowJo V10 軟件進行分析,用GraphPad prism8 繪制圖形,進行統(tǒng)計學(xué)分析時用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示實驗結(jié)果,對不同T 細胞刺激劑的實驗數(shù)據(jù)組間進行差異分析,“ns”表示P＞0.05,沒有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義,用“*”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同T 細胞刺激劑刺激PBMC 時,早期活化標(biāo)志物CD69 分子的表達情況

PBMC 經(jīng) α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激后,2 h時在CD4+T 細胞和CD8+T 細胞上就可以檢測到CD69 的表達,其中 CD69+CD4+T 細胞的比例為(18.000±1.908)%,CD69+CD8+T 細胞的比例為(14.867±1.762)%,2 h 后 CD69 在兩種主要的 T 細胞亞群上的表達呈直線上升趨勢。 24 h 時達到高峰,該時間點CD69 在CD4+T 細胞和CD8+T 細胞上所占比例分別為(94.333±1.365)%和(94.867±1.607)%,隨即呈下降趨勢(圖1A);雖然PHA-P+IL-2 刺激下的CD69 在兩種T 細胞亞群上的表達趨勢與 α-CD2/α-CD3/α-CD28 作用后的趨勢大致相似,但前者刺激下的CD69 的表達量遠低于后者;在PMA+lonomycin 刺激后,CD69 的表達均呈低水平緩慢增加,在72 h 的占比分別為(13.233±1.986)%(CD69+CD4+T 細胞)和(11.667±1.850)%(CD69+CD8+T 細胞)。

將三種刺激劑作用72 h 后的CD69 的表達量分別進行兩組間的比較分析,結(jié)果表明均具有顯著性差異,且 α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激后的結(jié)果顯著高于其他兩種刺激劑(P＜0.0005,圖1B)。 從中可以看出,α-CD2/α-CD3/α-CD28 激活 T 細胞效率最高,PHA-P+IL-2 次之,PMA+lonomycin 激活效率最低。

2.2 不同T 細胞刺激劑刺激PBMC 時,晚期活化標(biāo)志物CD38 分子和HLA-DR 分子的表達情況

α-CD2/α-CD3/α-CD28 作 用 于 PBMC 后,CD38+CD4+T 細胞和CD38+CD8+T 細胞所占比例均在120 h 時達高峰,比例分別為(90.533±1.986)%和(87.133 ± 2.511)%; 而 PHA-P + IL-2 作 用 于PBMC 后,CD38 的表達呈緩慢上升趨勢,CD38+CD4+T 細胞和CD38+CD8+T 細胞在168 h 的占比分別為(89.300±2.524)%和(89.900±2.252)%;PMA+Ionomycin 刺激后,CD38+CD4+T 細胞和 CD38+CD8+T 細胞所占比例在6 h 到達高峰,之后呈下降趨勢(圖2A)。 和CD38 不一樣,三種刺激劑作用后的 HLA-DR 的表達量均很低。 α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激下,HLA-DR+CD4+T 細胞在所有時間點中的最大比例為(4.150±1.570)%,HLA-DR+CD8+T細胞在所有時間點中的最大比例為(2.390 ±0.875)%;PHA-P+IL-2 刺激后,HLA-DR 在 CD4+T細胞和CD8+T 細胞上的最大表達量分別為(1.923±0.194)%和(1.430±0.166)%;PMA+Ionomycin 刺激72 h 后,HLA-DR+CD4+T 細胞和 HLA-DR+CD8+T細胞的占比分別為(4.010±0.783)%和(4.413±1.090)%(圖2B),將三種刺激劑作用 72 h 后的CD38 在兩種主要T 細胞亞群上的表達量進行組間比對,其中PMA+Ionomycin 與其他兩種刺激劑組間比對均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01,圖2C),而α-CD2/α-CD3/α-CD28 與 PHA-P+IL-2 組間比對表明 PMA+Ionomycin 刺激效果最差(無差異,圖2C)。

圖1 不同刺激劑作用后,CD4+T 細胞和CD8+T 細胞上CD69 的表達量變化Note. A, Expression of CD69 on T cells stimulated by different stimulants. B, Percentage of CD69+CD4+T cells and CD69+CD8+T cells stimulated for 72 h by different stimulants. C, Representative dot plots showing gating strategy for CD69 molecular.Compared with the group stimulated by α-CD2/α-CD3/α-CD28, ****P ＜ 0.0001. Compared with the group stimulated by PMA+lonomycin , ****P ＜ 0.0001,***P＜0.001. Compared with the group stimulated by PHA+IL-2 , ****P＜0.0001, ***P＜0.001.Figure 1 Expression of CD69 on CD4+T cells and CD8+T cells stimulated by different stimulants

將三種刺激劑作用72 h 后的HLA-DR 的表達量進行組間比對,只有PMA+Ionomycin 與PHA-P+IL-2 組間有差異(P＜0.01,圖 2C)。

2.3 不同T 細胞刺激劑刺激PBMC 時,增殖標(biāo)記Ki67 分子的表達情況

α-CD2/α-CD3/α-CD28 作用于 PBMC 后,Ki67+CD4+T 細胞和Ki67+CD8+T 細胞的比例在72 h 內(nèi)快速上升,之后緩慢上升,120 h 后快速下降,所有時間點中最大比例分別為(87.067 ± 2.113)% 和(95.167±2.550)%;PHA-P+IL-2 刺激后,Ki67 在兩種T 細胞亞群中的比例在168 h 內(nèi)緩慢上升,168 h時Ki67+CD4+T 細胞的所占比例為(35.633 ±3.951)%,Ki67+CD8+T 細胞的所占比例為(22.933±2.804)%;PMA+Ionomycin 刺激后,Ki67+CD4+T 細胞和Ki67+CD8+T 細胞的比例在72 h 內(nèi)緩慢下降(圖3A)。 將三種刺激劑作用72 h 后的Ki67 的表達量進行組間比較,其中 α-CD2/α-CD3/α-CD28 與其他兩種刺激劑組間比對均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.0001,圖3B)。 該結(jié)果與細胞圖片結(jié)果趨于一致,細胞圖片顯示,相比正常 PBMC,α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激 PBMC 72 h 后,細胞形狀變大,數(shù)量變多,呈梭狀或圓形;PHA-P+IL-2 刺激 PBMC 72 h后,細胞黏附成團;PMA+Ionomycin 刺激PBMC 72 h后,細胞幾乎全部死亡(圖3C、3D)。

3 討論

外周血單個核細胞因其重要的作用常被作為許多疾病中研究T 細胞激活的靶細胞。 由于不同刺激劑活化T 細胞所涉及的信號通路不一樣,因此理論上T 細胞被激活的效率和規(guī)律也不一樣[13-14]。為確定不同刺激劑誘導(dǎo)活化T 淋巴細胞的基本規(guī)律,本研究選用了 α-CD2/α-CD3/α-CD28、PHA-P+IL-2 和PMA+Ionomycin 三種常用的刺激劑組合,運用流式細胞術(shù)檢測活化分子在兩種主要T 細胞亞群上的表達量來確定T 細胞活化效率。

CD69 分子是T 細胞早期活化標(biāo)志物。 T 細胞接受活化信號后,在2 h 就可以檢測到CD69 的表達,在24 h 左右達到高峰,3 d 內(nèi)在T 細胞表面平穩(wěn)表達,之后開始下降[1-2]。 本研究中,經(jīng) α-CD2/α-CD3/α-CD28 和 PHA-P +IL-2 刺激后,T 細胞上CD69 的表達趨勢與文獻中基本相符。 三種刺激劑中,經(jīng) α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激后,T 細胞上CD69 的表達量顯著高于其他兩種刺激劑。 而PMA+Ionomycin 刺激后的CD69 的表達遠遠低于另外兩種刺激劑,表明PMA+Ionomycin 刺激效率低下。

圖2 不同刺激劑作用后,CD4+T 細胞和CD8+T 細胞上CD38、HLA-DR 的表達量變化Note. A, Expression of CD38 on T cells stimulated by different stimulants. B, Expression of HLA-DR on T cells stimulated by different stimulants.C, Percentage of CD38 and HLA-DRon CD4+T cells and CD8+T cells stimulated for 72 h by different stimulants.D, Representative dot plots showing gating strategy for CD38 molecular and HLA-DR molecular.Figure 2 Expression of CD38 and HLA-DR on CD4+T cells and CD8+T cells stimulated by different stimulants

圖3 不同刺激劑作用后,CD4+T 細胞和CD8+T 細胞上Ki67 的表達量Note. A, Expression of Ki67 on T cells stimulated by different stimulants. B,Percentage of Ki67+CD4+T cells and Ki67+CD8+T cells stimulated for 72 h by different stimulants. C, Representative dot plots showing gating strategy for Ki67. D, The PBMC befor and 72 h after stimulation.Figure 3 Expression of Ki67 on CD4+T cells and CD8+T cells stimulated by different stimulants

CD38 分子是一種常用的活化標(biāo)志物,在T 淋巴細胞活化晚期表達[4],常與同為T 細胞晚期活化標(biāo)志物的HLA-DR 分子聯(lián)合使用[15-16]。 本研究中,經(jīng)三種刺激劑作用72 h 后,CD38+CD4+T 細胞和CD38+CD8+T 細胞的占比在 α-CD2/α-CD3/α-CD28與 PHA-P + IL-2 組間無差異, 且高于 PMA +Ionomycin 刺激后的結(jié)果。 T 細胞上 HLA-DR 的表達量在三種刺激劑刺激后均很低,經(jīng) α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激 后的 HLA-DR+CD4+T 細胞 和HLA-DR+CD8+T 細胞的比例與另外兩種刺激劑組間比對無差異,而PMA+Ionomycin 刺激后的HLADR 在兩種主要T 細胞亞群上的表達量高于PHA-P+IL-2。

Ki67 是一種T 細胞增殖標(biāo)記,在細胞周期的各階段中除了G0 期外都會高度表達[17-18]。 本文中,經(jīng)PMA+Ionomycin 刺激后,T 細胞上Ki67 的表達量低下,α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激后的 Ki67 表達量顯著優(yōu)于其他兩種刺激劑。 且將三種刺激劑作用72 h 后的T 細胞上Ki67 的表達量進行組間比對,均顯示有顯著性差異(P＜0.0001)。 細胞圖片顯示,在不同刺激劑作用PBMC 72 h 后,細胞或增大呈梭狀圓形且數(shù)量增多(α-CD2/α-CD3/α-CD28),或黏附成團(PHA + IL-2), 或基本全部死亡(PMA +Ionomycin),這與不同刺激劑刺激后的Ki67 的表達相符:α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激后 72 h 時,Ki67+CD4+T 細胞和 Ki67+CD8+T 細胞的比例基本達峰值,PMA+Ionomycin 刺激后 72 h 時,Ki67+CD4+T 細胞和Ki67+CD8+T 細胞的比例在檢測的所有時間點中最低。 PHA-P+IL-2 作用于細胞后,造成細胞黏附,在流式儀上樣時可能會堵塞進樣針,從而可能會造成實驗結(jié)果的誤差。

綜上所述,α-CD2/α-CD3/α-CD28、PHA-P+IL-2和 PMA+Ionomycin 三種刺激劑中,α-CD2/α-CD3/α-CD28 活化 T 細胞的效率最優(yōu),PHA-P +IL-2 次之,PMA+Ionomycin 效率最差。 在 α-CD2/α-CD3/α-CD28 刺激下,CD69 和 Ki67 在兩種 T 細胞亞群上的表達量顯著高于其他兩種T 細胞刺激劑。 同一種活化分子在不同T 細胞亞群上的表達量不一樣,可能與T 細胞亞群的增殖速率不同有關(guān),也可能與不同T 細胞亞群上表達的活化分子在疾病中所起的作用不同有關(guān)。 PMA+Ionomycin 的刺激效率最低,可能是因為其活化T 細胞涉及的信號通路不像α-CD2/α-CD3/α-CD28 能引起強烈的下游信號傳導(dǎo),也可能是因為PMA+Ionomycin 作用于細胞后,隨著時間的延長,細胞死亡率增大,因此該刺激劑更適合作為短期刺激劑來使用。