張 田,喻國(guó)凍,顧 平,葉惠平,金 瑩

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科,貴陽(yáng) 550004)

急性鼻竇炎是一種鼻竇黏膜的炎癥性疾病[1],作為耳鼻喉科最常見的疾病之一,在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率。 在我國(guó),急性鼻竇炎的發(fā)病率逐年增加,主要臨床癥狀包括頭痛,鼻塞、記憶力下降等[2],其病情反復(fù),難以治愈,嚴(yán)重影響患者的身心健康,是臨床上亟需解決的健康問題。 目前,關(guān)于鼻竇炎的治療手段主要是采用鼻內(nèi)鏡外科手術(shù)及抗炎藥物[3-4],對(duì)于患者創(chuàng)傷性大,而且預(yù)后效果不佳,存在復(fù)發(fā)率高、耐藥性以及其他不良反應(yīng)等一系列問題。 新安鼻淵方流浸膏由中草藥敗醬草、黃芪等藥物組成,主要用于治療急、慢性鼻竇炎,起效迅速,且經(jīng)過長(zhǎng)期臨床使用證實(shí)其療效確切[5]。 但是對(duì)于新安鼻淵方流浸膏改善急性鼻竇炎的機(jī)制研究還未見報(bào)道,因此本研究通過建立大鼠急性鼻竇炎模型來(lái)探討新安鼻淵方流浸膏對(duì)大鼠急性鼻竇炎嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡影響的相關(guān)機(jī)制,為進(jìn)一步研究以及臨床用藥提供客觀的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～10 周齡 SPF 級(jí) SD 雄性大鼠,體重(200±20) g 40 只購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011],依照我院最新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理辦法,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在本實(shí)驗(yàn)室SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)[SYXK(黔)2018-0001],每籠 3 ～4 只動(dòng)物,自由飲水、攝食,12 h 光照/ 12 h 黑暗,溫度 20℃ ～25℃,相對(duì)濕度 40%～70%。,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后入組,進(jìn)行相應(yīng)的操作。 整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷,本實(shí)驗(yàn)獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC2018-027)。

1.2 主要試劑與儀器

新安鼻淵方流浸膏由我院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室制備;金黃色葡萄球菌由我院微生物室從患者標(biāo)本中分離獲得;AMD3100 購(gòu)買于美國(guó)Sigma 公司;TNF-α、IL-1β 酶聯(lián)免疫試劑盒以及 AEC 顯色試劑盒、PBS 購(gòu)買于北京索萊寶科技有限公司;嗅標(biāo)記蛋白(olfactorymarkerprotein,OMP)、TUNEL、SDF-1 以及CXCR4 免疫組化試劑以及 cleaved caspase 3、Bax 以及Bcl-2 一抗試劑盒購(gòu)買于英國(guó)Abcam 公司;切片機(jī)(Leica,德國(guó));倒置顯微鏡(OLYMPUS,日本);高速離心機(jī)(Eppendorf,德國(guó));紫外分光光度計(jì)(Thermo,美國(guó));超低溫冰箱(Siemens,德國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及建模

本研究中40 只大鼠分為4 組每組10 只,包括對(duì)照組,模型組(急性鼻竇炎),治療組(急性鼻竇炎+新安鼻淵方流浸膏),抑制劑組(急性鼻竇炎+CXCR4 特異性抑制劑AMD3100)。 除對(duì)照組外,其余各組大鼠均構(gòu)建急性鼻竇炎模型,建模過程如下:麻醉大鼠,剃除鼻背部毛、沿鼻中線部位皮下注射利多卡因麻醉大鼠,切開皮膚,分離粘膜以暴露上頜竇前壁區(qū),可見左側(cè)上頜竇前壁,暴露上頜竇骨壁,采用2 mm 鉆頭鉆開上頜竇前壁,將無(wú)菌生物止血棉塞入竇腔,0.2 mL 金黃色葡萄球菌懸液注入竇腔,縫合傷口,對(duì)照組注射等量無(wú)菌生理鹽水代替,其余操作與同上。 造模后第7 天開始采用灌胃方式連續(xù)給藥1 周,每天1 次。 其中治療組給藥新安鼻淵方流浸膏按照大鼠體重計(jì)算(7 g/kg),抑制劑組給予1 mg/kg AMD3100,對(duì)照組以及模型組灌胃等量的生理鹽水。 模型的建立通過大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分進(jìn)行檢測(cè)[5]:于給藥前、末次給藥后1 h 分別觀察30 min 內(nèi)大鼠鼻竇炎癥狀,評(píng)分規(guī)則如表1,鼻竇炎癥狀評(píng)分總計(jì)大于7 分認(rèn)為模型建立成功。

1.3.2 鼻粘膜組織炎性細(xì)胞因子檢測(cè)

將各組大鼠處死后,分離鼻粘膜并用生理鹽水洗滌,收集鼻腔流出液體,離心取上清,采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒對(duì)各組大鼠鼻腔灌洗液中炎性因子TNF-α 以及 IL-1β 的濃度進(jìn)行測(cè)定。 使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度,用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子以及對(duì)應(yīng)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣本中TNF-α 以及 IL-1β 的濃度。

1.3.3 免疫熒光觀察OMP 蛋白的表達(dá)

處死動(dòng)物后,用手術(shù)刀劃取左側(cè)竇口1 mm×1 mm 大小鼻頂部黏膜,4%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟切片。 切片經(jīng)PBS 漂洗后加入蛋白酶K-鹽酸緩沖液恒溫孵育20 min,再經(jīng)PBS 漂洗后加入山羊血清封閉30 min;滴加稀釋好的(1 ∶500)山羊抗鼠OMP,4℃過夜;再加稀釋好的(1 ∶500)兔抗山羊熒光二抗,PBS 漂洗后甘油封片,置于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.4 HE 以及免疫組化檢測(cè)

將上述制備好的各組大鼠的石蠟切片采用二甲苯脫蠟,乙醇脫水,過氧化物酶滅活,血清封閉后分別加入SDF-1 以及CXCR4 的一抗,4℃ 條件下過夜孵育;加入二抗,孵育30 min 后加入鏈霉素卵白素工作液并在37℃條件下孵育30 min;使用DAB顯色,顯微鏡下觀察染色情況。 陽(yáng)性細(xì)胞表示為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色,并采用Image J 軟件對(duì)于對(duì)各組光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.5 TUNEL 染色檢測(cè)各組大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡

取各組大鼠嗅上皮組織,常規(guī)方法固定,石蠟包埋切片,二甲苯浸洗兩次,梯度乙醇浸洗5 min,風(fēng)干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,然后4℃預(yù)冷乙醇上進(jìn)行如下操作:0.1%TRItonX-100、0.1%緩沖液處理2 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,加入TUNEL 反應(yīng)混合液,封口膜密封,暗濕盒反應(yīng)1 h,溫度37℃,PBS 漂洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡進(jìn)行觀察,采用Image J 軟件對(duì)各組光密度值進(jìn)行分析。

表1 急性鼻竇炎癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Score criteria for acute sinusitis symptoms

1.3.6 Western blot 檢測(cè)

將各組大鼠嗅上皮組織樣本加入300 μL RIPA裂解液,裂解10 min 后離心5 min(15000 r/min),收集上清。 每組上樣20 μg 蛋白樣本。 將蛋白樣品和上樣緩沖液混合均勻,100℃水浴變性3 min,采用10% SDS-PAGE 分離膠電泳,轉(zhuǎn)膜,室溫封閉2 h,加入稀釋后的 cleaved caspase 3 一抗(1 ∶1000)、Bax 一抗(1 ∶500)、Bcl-2 一抗(1 ∶500)、β-actin 一抗(1 ∶2500),搖床 4℃孵育過夜。 復(fù)溫后用 PBST 洗滌PVDF 膜三次后加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG,37℃孵育2 h 之后ECL 顯影拍照,保存圖像, Image J 軟件分析條帶的灰度值,以β-actin 作為內(nèi)參計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用軟件 SPSS 21.0、GraphPad Prism 5 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s),兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn),P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分

給藥前模型組與各給藥組評(píng)分相比,評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),模型組和各治療組評(píng)分結(jié)果顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。 給藥后模型組評(píng)分顯著高于對(duì)照組,各治療組評(píng)分顯著低于模型組(P＜0.05),治療組與抑制劑組組在評(píng)分上相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)見表2。

2.2 OMP 熒光標(biāo)記結(jié)果

成熟的嗅上皮神經(jīng)細(xì)胞OMP 熒光染色后紅色熒光表示陽(yáng)性,本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本切片為OMP 陽(yáng)性細(xì)胞,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)取材位置為嗅覺黏膜,可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究,見圖1。

2.3 大鼠嗅上皮組織HE 染色以及炎性因子檢測(cè)

與對(duì)照組比較,模型組大鼠嗅上皮組織損傷嚴(yán)重,且 TNF-α 以及 IL-1β 顯著增加(P＜0.05);治療組與模型組相比嗅上皮組織損傷減輕,TNF-α 以及IL-1β 表達(dá)明顯降低(P＜0.05);治療組組與抑制劑組相比,炎性因子 TNF-α 以及 IL-1β 表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05),見圖 2。

2.4 大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組比較,模型組大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡顯著增多(P＜0.05);與模型組相比,治療組組與抑制劑組大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少(P＜0.05),治療組與抑制劑組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)見圖 3。

2.5 大鼠嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達(dá)

相比于對(duì)照組,模型組大鼠嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05);治療組與抑制劑組大鼠與模型組相比嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05);治療組與抑制劑組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05),見圖4。

2.6 大鼠嗅上皮組織caspase-3、Bax 以及Bcl-2 的表達(dá)

相比于對(duì)照組,模型組大鼠嗅上皮組織重促凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bax 的表達(dá)顯著升高(P＜0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05);治療組與抑制劑組大鼠與模型組相比嗅上皮組織促凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bax 的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)顯著增加(P＜0.05);治療組與抑制劑組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05),見圖 5。

3 討論

急性鼻竇炎是發(fā)生于鼻竇粘膜的一種炎癥性疾病,主要病理特征為各種竇口狹窄或阻塞,以及黏膜纖毛功能發(fā)生障礙。 作為耳鼻咽喉科的常見病和多發(fā)病,其主要的臨床表現(xiàn)為嗅覺功能障礙,同時(shí)會(huì)伴有鼻塞、鼻癢、流涕、打噴嚏、頭痛、頭昏等癥狀[6]。 其病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚不明確,牽涉因素眾多,可能與細(xì)菌感染、過敏反應(yīng)、環(huán)境因素等多種因素有關(guān)[7-9]。 在急性期若沒有得到及時(shí)治療則會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁员歉]炎,嚴(yán)重影響患者正常生活。

近年來(lái),中藥應(yīng)用于鼻炎的研究受到眾多研究者的重視[10-11]。 新安鼻淵方流浸膏主要包含中藥敗醬草、黃芪、魚腥草、辛夷等[12-13]。 該方具有清熱解毒、祛瘀排膿、止痛通竅的功效。 敗醬草具清熱解毒、排膿消癰、止痛之功,被廣泛用于治療肺經(jīng)蘊(yùn)熱、膽經(jīng)(腑)郁熱所導(dǎo)致的鼻淵癥狀[14]。 黃芪能排膿通竅,補(bǔ)益正氣,斂瘡生肌,現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)其可增強(qiáng)機(jī)體免疫[15]。 相關(guān)研究[5]表明新安鼻淵方流浸膏對(duì)于急性鼻竇炎有很好的治療效果。 常見的急性鼻竇炎致病菌有金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等[16],因此本研究中,采用金黃色葡萄球菌構(gòu)建急性鼻竇炎大鼠模型。 結(jié)果表明模型組大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分以及嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比例顯著多于對(duì)照組,證明模型建立成功。 新安鼻淵方流浸膏組大鼠的嗅上皮神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯低于模型組,表明新安鼻淵方流浸膏對(duì)于大鼠急性鼻竇炎具有明顯的改善作用。 但是,對(duì)于新安鼻淵方流浸膏治療急性鼻竇炎的相關(guān)機(jī)制目前仍不清楚。 因此,本研究構(gòu)建大鼠急性鼻竇炎模型來(lái)探究新安鼻淵方流浸膏對(duì)于鼻竇炎的調(diào)節(jié)作用以及其相關(guān)機(jī)制。

圖1 OMP 免疫熒光結(jié)果Figure 1 Results of OMP immunofluorescence

圖2 HE 染色觀察各組大鼠鼻黏膜病理變化Note. A, Control group. B, Model group. C, Treatment group. D,Inhibitor group. Compared with the control group, *P ＜0.05.Compared with the model group, #P ＜0.05. The same as below.Arrow indicates eosinophilic infiltration.Figure 2 Pathological changes of nasal mucosa of rats in each group were observed by HE staining

圖3 各組大鼠嗅上神經(jīng)元細(xì)胞凋亡Figure 3 Apoptosis of upper olfactory neurons in each group

圖4 免疫組化檢測(cè)各組大鼠SDF-1、CXCR4 的表達(dá)Figure 4 Expression of SDF-1 and CXCR4 in each group was detected by immunohistochemistry

圖 5 caspase-3、Bax 以及 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平Note. A, Control group. B, Model group. C, Treatment group. D,Inhibitor group. Compared with control group,*P＜0.05.Compared with the model group,#P＜0.01.Figure 5 Expression levels of cleaved caspase 3, Bax and Bcl-2

表2 給藥前后大鼠鼻竇炎評(píng)分表(n=10)Table 2 Scores of sinusitis of rats before and after administration

近年來(lái),趨化因子受體 CXCR4 以及 SDF-1/CXCR4 相互作用形成的信號(hào)通路由于參與多種疾病的發(fā)生以及發(fā)展而備受關(guān)注[17]。 其中SDF-1 作為一種趨化因子,由炎性反應(yīng)因子如TNF-α、IL-1β所誘導(dǎo),由于其對(duì)炎性反應(yīng)細(xì)胞具有強(qiáng)大的趨化能力,因此常被作為炎性反應(yīng)的特異性指標(biāo)。 此外,CXCR4 是一個(gè)G 蛋白偶聯(lián)受體,作為SDF-1 唯一的受體,CXCR4 多表達(dá)于免疫細(xì)胞之中,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。 目前,研究證明SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯的調(diào)節(jié)作用[18-19]。 此外,相關(guān)研究[20-21]表明SDF-1/CXCR4 在鼻炎鼻粘膜中呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象,提示該通路參與鼻炎鼻粘膜病變的發(fā)生和發(fā)展。 B 淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)是一種抗凋亡蛋白,以線粒體為單位參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控,其同源二聚體X 蛋白(Bax)是一種促凋亡蛋白,Bcl-2 和Bax 是在凋亡調(diào)控過程中功能對(duì)立的一對(duì)重要的調(diào)控基因,cleaved caspase 3 作為凋亡過程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶誘發(fā)細(xì)胞凋亡[22-23]。 眾多研究[24-25]證實(shí):SDF-1/CXCR4 通路的激活導(dǎo)致 Bax、cleaved caspase 3 等促凋亡蛋白表達(dá)升高,抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 本研究中,相比于模型組,治療組大鼠SDF-1 以及CXCR4 的表達(dá)顯著降低,同時(shí)促凋亡蛋白表達(dá)明顯降低,抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著增高,而給予CXCR4 特異性抑制劑AMD3100 處理后,大鼠病理變化與治療組相似。 以上結(jié)果提示,新安鼻淵方流浸膏對(duì)于急性鼻竇炎大鼠嗅上神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的改善作用可能是通過抑制SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究通過建立大鼠急性鼻竇炎模型驗(yàn)證了新安鼻淵方流浸膏可能通過抑制SDF-1/CXCR4 的表達(dá),從而抑制嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,最終改善急性鼻竇炎癥狀。 然而急性鼻竇炎的發(fā)生發(fā)展涉及因素眾多,機(jī)制復(fù)雜,因此新安鼻淵方流浸膏改善變急性鼻竇炎嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待深入研究。