田 勇,董其娟,于江紅,韓 超

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院(鄭州人民醫(yī)院)內(nèi)分泌代謝科,鄭州 450003;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科,鄭州 450052)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是全球發(fā)病率較高的代謝性疾病,以高血糖為主要特征,常伴隨有眼、腎、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的多種并發(fā)癥[1]。 糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabeticretinitis, DR)是DM 并發(fā)癥中較為常見的一種疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì),DM 患者視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率為35%,是發(fā)達(dá)國家勞動(dòng)人口失明的主要原因[2]。 DR 主要由慢性高血糖環(huán)境誘發(fā),故目前治療大多以控制DM 患者血糖為主,但仍有部分患者治療效果不佳[3]。 研究證明,DR 的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)顯著減少和凋亡,抑制RGCs 功能受損和丟失可顯著減輕DR[4]。 胰激肽原酶又稱為血管舒緩素,是存在于人和哺乳動(dòng)物胰腺中的一種蛋白水解酶,具有擴(kuò)血管、改善微循環(huán)的作用,臨床主要用于治療糖尿病腎病,防止糖尿病微血管病變[5]。近年來,胰激肽原酶在DR 的臨床治療中取得了較好的療效,可與其他藥物聯(lián)合使用改善DR 患者視網(wǎng)膜血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),增加視網(wǎng)膜厚度,提高患者視力[6-7]。 Notch 信號(hào)通路是一種在人和動(dòng)物中高度保守的信號(hào)通路,與腫瘤、心血管和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病密切相關(guān),Hes 已被證實(shí)是該信號(hào)通路的關(guān)鍵靶基因[8]。 研究證明,Notch 信號(hào)通路在DR 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,可通過調(diào)節(jié)血管功能調(diào)控新生血管的重構(gòu)或退化,是治療DR 的潛在靶點(diǎn)[9]。 目前,雖已有研究證明胰激肽原酶能夠治療DR,但其具體作用機(jī)制尚不清晰。 本研究建立大鼠 DM 模型,觀察胰激肽原酶對(duì) DM 大鼠RGCs 的保護(hù)作用,并初步探究其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí) SD 大鼠 60 只,6 周齡,體重 180～220 g,雌雄各半,購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(豫)2017-0001],飼養(yǎng)在河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立動(dòng)物房[SYXK(豫)2016-0002]。 飼養(yǎng)條件:室溫(22±2)℃,濕度(50±10)%,每天定時(shí)換氣,保持12 h ∶12 h 光暗照明,食水不限。 研究方案獲鄭州人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC:ZZRMYY2019005),實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

注射用胰激肽原酶(常州千紅藥業(yè),批號(hào):481912052A);鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ,Sigma-Aldrich,批號(hào):V900890-1G);HE 染色試劑盒、中性樹膠、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);蛋白定量試劑盒(博士德生物);RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo Scientific);引物(日本 TaKaRa);Notch1、Hes1、GAPDH 兔源單克隆抗體,羊抗兔二抗(美國CST 公司);One Touch II 型血糖儀(美國強(qiáng)生公司);DYCZ-24KS 型雙板垂直電泳儀(北京六一儀器廠);IX53 顯微鏡(日本奧林巴斯);G:BOX 多功能凝膠成像系統(tǒng)(Syngene);M ultiskan MK3 酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific);TGL16 MB 高速冷凍離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司);7500 型PCR儀(美國Applied Biosystems)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、造模與給藥

將60 只SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和治療組,每組20 只。 模型組和治療組大鼠提前禁食12 h,腹腔注射60 mg/kg STZ 溶液,空白組大鼠腹腔注射等量0.1 moL/L 枸櫞酸鈉溶液。 造模72 h 后,各組大鼠尾靜脈取血,檢測血糖值≥16.7 mmol/L者即可認(rèn)為DM 模型建立成功[10]。 經(jīng)檢測,模型組和治療組造模成功的大鼠均為18 只。 造模成功后第2 天開始給藥,治療組大鼠腹腔注射胰激肽原酶0.8 U 治療,空白組和模型組腹腔注射0.2 mL 生理鹽水,每天1 次,連續(xù)2 周。

1.3.2 HE 染色觀察RGCs 病理學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,摘除大鼠左側(cè)眼球,置于4%多聚甲醛中固定48 h,用于HE 染色和TUNEL 檢測。 切片固定后蒸餾水清洗,然后置于不同濃度的乙醇中進(jìn)行梯度脫水,制作組織蠟塊,冰上預(yù)冷切片,切片厚度為4 μm,二甲苯脫蠟30 min,在不同濃度梯度的乙醇溶液中復(fù)水,使用蘇木精和伊紅染液分別染細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),脫水、透明后用中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜各層病理變化,隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行RGCs 計(jì)數(shù),取平均值。

1.3.3 TUNEL 法檢測RGCs 凋亡情況

切片制備方法同1.3.2。 切片標(biāo)本常規(guī)脫蠟、復(fù)水,滴加蛋白酶K 溶液,室溫水解15 min 去除組織蛋白,蒸餾水清洗后放置在含2%過氧化氫的PBS中反應(yīng)5 min,滴加TDT 酶反應(yīng)液2 滴,置濕盒中37℃孵育1 h,滴加50 μL 過氧化物標(biāo)記的抗地高辛抗體,濕盒中室溫孵育0.5 h,PBS 清洗后滴加DAB溶液,室溫孵育3 ～6 min 顯色,蒸餾水終止,蘇木精染細(xì)胞核2 min,脫水、透明后用中性樹膠封片,顯微鏡高倍鏡下觀察凋亡細(xì)胞陽性細(xì)胞率。

1.3.4 視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平檢測

摘除大鼠右側(cè)眼球,解剖鏡下小心剝離視網(wǎng)膜組織,按照1 ∶4體積比在組織中加入PBS 冰上制備成勻漿,10000 r/min 離心10 min 取上清,離心半徑為 12.5 cm,分裝在 EP 管中,-80℃保存。 ①SOD 活性檢測:取待測樣品20 μL,依次加入SOD 檢測緩沖液、WST-8 工作液和反應(yīng)啟動(dòng)工作液,37℃孵育30 min,450 nm 波長測定吸光度(A)值,計(jì)算抑制百分率,抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定)/ΔA空白×100%,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的SOD 酶活力(U/mg)。②MDA 含量檢測:取待測樣品100 μL,依次加入工作液、蒸餾水和待測樣品,置于100℃水浴中孵育60 min,冰浴冷卻,9500 r/min 常溫離心10 min,吸取200 μL 上清液加入玻璃比色皿中,測定各樣品在450 nm、532 nm 和 600 nm 處的吸光度 A 值,計(jì)算ΔA450=A450測定-A450空白,ΔA532=A532測定-A532空白,ΔA600=A600測定-A600空白,MDA 含量(nmol/mg)= 5×[12.9×(ΔA532-ΔA600)-2.58×ΔA450]。

1.3.5 qRT-PCR 法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes-1 mRNA 表達(dá)

收集大鼠視網(wǎng)膜組織,方法同1.3.4。 將視網(wǎng)膜組織剪碎,加適量 TRIzol 裂解液提取組織總RNA,使用 RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,作為熒光定量模版。引物由日本Takara 公司設(shè)計(jì)合成,所有樣品均以GAPDH 為內(nèi)參。 反應(yīng)體系:dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq 酶 0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL +上下游引物分別1 μL,加去離子水至總體積 25 μL。 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5 min,95℃變性 30 s、62℃退火 30 s、72℃延伸 30 s,重復(fù) 40 個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃ 5 min 終止反應(yīng),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化。 引物序列見表1。

1.3.6 Western blot 法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes-1 蛋白表達(dá)

收集大鼠視網(wǎng)膜組織,方法同1.3.4。 各組視網(wǎng)膜組織用眼科鑷剪碎,加入裂解液提取組織蛋白,BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,加入loading buffer,在EP 管中混勻后置于沸水中煮沸5 min 使蛋白變性。 配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,上樣后80 V 電泳2 h,60 V轉(zhuǎn)膜2 h,5%脫脂奶粉封閉2 h,隨后將條帶放入10 mL Notch1(1 ∶1000)、Hes-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1000)兔源一抗稀釋液中,稀釋比例分別為,4℃環(huán)境下孵育12 h,第2 天用TBST 緩沖液清洗3 次,每次10 min,然后加入羊抗兔二抗(1 ∶2000)中,在37℃環(huán)境下孵育2 h,TBST 緩沖液清洗3 次后滴加ECL 發(fā)光液,反應(yīng)1 min 后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。免疫印跡實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參蛋白為GAPDH,用Image J 軟件分析各個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的灰度值,計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量,蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),GraphPad Prism 8.0 作圖,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠RGCs 病理學(xué)變化

空白組大鼠的視網(wǎng)膜組織各層結(jié)構(gòu)清晰,RGCs排列整齊有序,細(xì)胞核清晰;與空白組比較,模型組RGCs 排列紊亂、不規(guī)則,細(xì)胞核稀疏;與模型組比較,治療組視網(wǎng)膜組織各層結(jié)構(gòu)清晰,RGCs 細(xì)胞核較為清晰且排列整齊。 見圖1。 空白組、模型組和治療組RGCs 層細(xì)胞數(shù)量分別為(29.54±1.35)、(10.28±1.29)、(20.68±1.52),三組 RGCs 數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=52.36,P=0.0008);與空白組比較,模型組和治療組RGCs 層細(xì)胞數(shù)量均降低(P=0.005,0.039);與模型組比較,治療組RGCs 層細(xì)胞數(shù)量增加(P=0.028)。 見圖2。

2.2 各組大鼠RGCs 凋亡情況比較

空白組大鼠視網(wǎng)膜RGCs 層偶見TUNEL 陽性細(xì)胞,與空白組比較,模型組可見較多的呈深棕色的TUNEL 陽性細(xì)胞染色;與模型組比較,治療組雖有TUNEL 陽性細(xì)胞,但數(shù)量較少,陽性細(xì)胞染色較淺。 見圖3。 空白組、模型組和治療組RGCs 凋亡率分別為(0.55±0.20)、(33.33±0.25)、(16.51±0.23)%,三組間RGCs 凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.21,P=0.0003),進(jìn)一步兩兩比較,模型組和治療組RGCs 凋亡率顯著高于空白組(P=0.005,0.008);與模型組比較,治療組RGCs 凋亡率顯著降低(P=0.017)。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD 活力和MDA 含量比較

空白組、模型組和治療組 SOD 水平分別為(80.33±4.22)、(38.85±3.14)、(75.68±3.95)U/mg,三組間SOD 水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.24,P= 0.000 1);MDA 含量分別為(0.81±0.09)、(3.70±0.12)、(1.52±0.10)nmol/mg,三組間SOD 水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.73,P=0.000 5)。 與空白組比較,模型組大鼠SOD 水平顯著降低,而 MDA 含量顯著升高(P= 0.021,0.003);與模型組比較,治療組SOD 活力顯著提高,MDA 含量顯著降低(P=0.035,0.024)。 見圖 4。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 mRNA 表達(dá)水平比較

空白組、模型組和治療組Notch1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為(0.98±0.09)、(0.25±0.03)、(0.59±0.07),三組間Notch1 mRNA 比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.21,P=0.002);Hes1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為(1.01±0.08)、(0.20±0.04)、(0.84±0.09),三組間Hes1 mRNA 比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.32,P=0.000 6)。 與空白組比較,模型組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 mRNA 表達(dá)水平顯著降低(P=0.005,0.006);與模型組比較,治療組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 mRNA 表達(dá)水平顯著升高(P=0.003,0.016)。 見圖 5。

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 蛋白表達(dá)水平比較

空白組、模型組和治療組Notch1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.99±0.09)、(0.26±0.05)、(0.48±0.06),三組間Notch1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.84,P=0.001);Hes1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(1.05±0.12)、(0.29±0.03)、(0.80±0.07),三組間Hes1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.58,P=0.003)。 與空白組比較,模型組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P=0.023,0.031);與模型組比較,治療組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P=0.019,0.026)。 見圖6。

圖1 各組大鼠RGCs 病理學(xué)變化(HE 染色)Figure 1 Pathological changes of RGCs in each group of rats(HE staining)

3 討論

圖2 各組大鼠RGCs 數(shù)量比較(ˉx±s,n=18)Note. Compared with the blank group,*P＜0.05, **P＜0.01.Compared with the model group, #P＜0.05.Figure 2 Comparison of the number of RGCs in each group

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織SOD 活力和MDA含量比較(ˉx±s,n=18)Note. Compared with the blank group, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01.Compared with the model group, #P＜0.05.Figure 4 Comparison of SOD activity and MDA content in retina tissue of rats in each group

圖3 各組大鼠RGCs 凋亡情況比較(TUNEL 染色)Figure 3 Comparison of RGCs apoptosis in rats in each group (TUNEL staining)

圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 mRNA表達(dá)水平比較(ˉx±s,n=18)Note. Compared with the blank group, *P＜0.05, **P＜0.01.Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Figure 5 Comparison of Notch1 and Hes1 mRNA expression levels in the retina of rats in each group

圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 蛋白表達(dá)水平比較(ˉx±s,n=18)Note. A, Blank group. B, Model group. C, Treatment group.Compared with the blank group, *P ＜0.05. Compared with the model group, #P＜0.05.Figure 6 Comparison of Notch1 and Hes1 protein expression levels in rat retina

DR 是DM 的常見并發(fā)癥之一,可導(dǎo)致RGCs 大量凋亡,而RGCs 被損傷可直接影響患者視力,嚴(yán)重者可導(dǎo)致失明[11]。 DR 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能的原因包括代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等,而RGCs 損傷是多因素、多途徑和多階段共同作用的結(jié)果[12]。 目前,DR 的治療方法包括藥物、激光、手術(shù)及基因治療,各種新的療法和途徑均在不斷深入探索中[13]。 胰激肽原酶是一種具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)作用的蛋白水解酶,近年來,被廣泛用于糖尿病腎病、周圍神經(jīng)性病變及DM 相關(guān)男性勃起功能障礙的治療[5,14-15]。 Cheng 等[16]研究表明,胰激肽原酶能夠預(yù)防DM 動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜病變,增加視網(wǎng)膜層厚度并減弱血管滲漏,是治療DR的一種新的治療劑,但其作用機(jī)制尚不清楚。 在本研究中,我們采用單次腹腔注射STZ 的方法建立大鼠DM 模型,觀察胰激肽原酶對(duì)大鼠DR 的保護(hù)作用,病理切片結(jié)果顯示,空白組大鼠的視網(wǎng)膜組織各層結(jié)構(gòu)清晰,RGCs 排列整齊有序,幾乎沒有凋亡細(xì)胞,而模型組大鼠的RGCs 排列紊亂、不規(guī)則,細(xì)胞核稀疏,細(xì)胞數(shù)量顯著減少,且凋亡細(xì)胞數(shù)量較多,陽性著色較深,與模型組比較,治療組視網(wǎng)膜RGCs 細(xì)胞核清晰,排列整齊,RGCs 數(shù)量顯著增加,凋亡細(xì)胞數(shù)量減少,陽性著色相對(duì)較淺,初步表明胰激肽原酶對(duì)DM 大鼠RGCs 具有保護(hù)作用,能夠提高RGCs 數(shù)量,防止細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激是Ⅱ型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的重要原因和過程,可導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞功能損傷及胰島素抵抗,另有研究表明,氧化應(yīng)激反應(yīng)與DR、青光眼和視神經(jīng)炎等多種疾病中RGCs 凋亡現(xiàn)象有關(guān),抗氧化應(yīng)激藥物的使用則可有效保護(hù)RGCs,降低RGCs 凋亡率,從而控制疾病發(fā)展[17-18]。 SOD 是人體重要的自由基清除劑,可阻斷氧自由基造成的細(xì)胞損害,保護(hù)受損細(xì)胞,MDA 是機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物,可使視網(wǎng)膜細(xì)胞的流通性和通透性改變,最終可導(dǎo)致視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損傷,當(dāng)視網(wǎng)膜缺血缺氧情況下,氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著增加,表現(xiàn)為SOD 活力降低而MDA水平升高[19]。 在本研究中,我們檢測了DM 大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD 和MDA 含量,結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠SOD 水平顯著降低,而MDA 含量顯著升高,與模型組比較,治療組SOD 活力顯著提高,MDA 含量顯著降低,表明胰激肽原酶能夠抑制DR 氧化應(yīng)激反應(yīng)。 Notch 信號(hào)通路是一種進(jìn)化保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,已有研究證明,Notch 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及血管新生,是機(jī)體新陳代謝的關(guān)鍵參與者,該信號(hào)通路的活化能夠減輕氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷[20-21]。 研究表明,Notch 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在視網(wǎng)膜血管形成過程中定期表達(dá),也通過調(diào)節(jié)血管直徑保持視網(wǎng)膜血管成熟穩(wěn)定,而Notch信號(hào)通路的表達(dá)缺失則使血管動(dòng)態(tài)平衡被破壞,對(duì)維持靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定至關(guān)重要[22]。 Li 等[23]研究發(fā)現(xiàn),Notch 信號(hào)通路能夠抑制急性高眼壓大鼠RGCs 細(xì)胞凋亡,促進(jìn)受損視神經(jīng)的再生。 劉文強(qiáng)等[24]認(rèn)為,激活Notch1/Hes-1 信號(hào)通路能夠?qū)M狀態(tài)下的RGCs 損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。 與上述研究結(jié)果一致,本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著低于空白組,與模型組比較,治療組大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1、Hes1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高,表明胰激肽原酶能夠上調(diào)DM 大鼠視網(wǎng)膜組織Notch1/Hes-1 信號(hào)通路的表達(dá)水平,進(jìn)而產(chǎn)生抑制RGCs 細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的作用。

綜上所述,胰激肽原酶能夠改善DM 大鼠視網(wǎng)膜病變,抑制RGCs 細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞凋亡,減少氧化應(yīng)激損傷,其作用機(jī)制可能與激活Notch1/Hes-1 信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)。