涂仕娟,陳 鵬,楊紅亞*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,成都 611137; 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,成都 611137)

針灸作為中醫(yī)學(xué)體系里的獨(dú)特分支,除秉承中醫(yī)整體調(diào)節(jié)和辨證論治的優(yōu)勢(shì)外,更具備操作簡(jiǎn)便、起效迅速、物理刺激不良反應(yīng)小等特點(diǎn)[1],隨之而來(lái)的針灸療效機(jī)制研究是目前中醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。 動(dòng)物模型為針灸療效機(jī)制研究提供了良好的載體,大鼠是針灸機(jī)制研究中最常用的動(dòng)物之一。 但是目前對(duì)大鼠針灸實(shí)驗(yàn)固定方法的研究較少,常用的固定方法有束縛法[2]、束袋法[3]、鼠筒法[2,4]、輸液瓶固定法[5]、置高臺(tái)法[6]等。 課題組在進(jìn)行膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)模型大鼠溫針灸治療時(shí)曾嘗試這些固定方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此類方法存在大鼠應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈、取穴部位受限、掉針、僅適合特定部位單純針刺,不適用于針灸治療、固定器型號(hào)只適用于限定體重動(dòng)物等局限性。 因此,選擇一種操作簡(jiǎn)便,又能減少針灸治療中動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的固定方法,是針灸機(jī)制研究中面臨的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

如何減少大鼠固定和治療過(guò)程的應(yīng)激反應(yīng)呢?筆者聯(lián)想到蕩秋千時(shí)雙腿懸空、足部無(wú)著力點(diǎn)、下肢無(wú)法發(fā)力的體驗(yàn),受此啟發(fā),反復(fù)實(shí)踐后設(shè)計(jì)了一種大鼠溫針灸的“鼠衣秋千式”固定方法,以KOA模型大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察固定及治療過(guò)程動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng),并評(píng)估該方法的適用范圍,同時(shí)與溫針灸治療中常用的束縛法進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果顯示,“鼠衣秋千式”固定法中的大鼠在固定及溫針灸治療過(guò)程中應(yīng)激反應(yīng)較小,四肢部位穴位充分暴露,1 名實(shí)驗(yàn)人員即可獨(dú)立完成對(duì)大鼠的固定和治療,操作簡(jiǎn)便。 現(xiàn)將“鼠衣秋千式”固定裝置的制作及使用方法介紹如下,供各位同仁參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 60 只,體重(250±20) g,7周齡,來(lái)源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新中心屏障環(huán)境動(dòng)物房[SYXK(川)2020-124]。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查(2019-14),并嚴(yán)格按照動(dòng)物使用的減少、優(yōu)化、替代“3R”原則進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.2 主要試劑與儀器

廢棄的白大褂(或舊衣料),剪刀,縫衣針,縫衣線,3 mm×400 mm 的自鎖式塑料尼龍?jiān)鷰?長(zhǎng)3 m、寬15 cm 布帶條1 根,S 形小號(hào)掛鉤若干,50 mm 規(guī)格的長(zhǎng)尾夾,小號(hào)鑷子,帆布手套,乳膠手套(海門市揚(yáng)子醫(yī)療器械有限公司);1 mL 一次性無(wú)菌注射器(成都市新津事豐醫(yī)療器械有限公司);0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司);碘乙酸鈉(MIA)(美國(guó) Sigma-Aldrich 公司);寵物電推剪(型號(hào):RFCZ-572,九江亨利電器有限公司);0.25 mm×25 mm 華佗牌一次性無(wú)菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);1.2 cm×1.5 cm 的小艾炷(湖南省高圣生物有限公司);碘酒(四川金山制藥有限公司);75%乙醇(山東安捷高科消毒科技有限公司),硬紙板,打火機(jī),艾灰盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后,選取體重(400±20) g的大鼠采用碘乙酸鈉(MIA)膝關(guān)節(jié)腔注射的方法復(fù)制KOA 模型[7-9],關(guān)節(jié)腔注射同等體積無(wú)菌生理鹽水的大鼠設(shè)置為空白組。 飼養(yǎng)環(huán)境日光燈12 h 明暗更替照明,安靜且通風(fēng),溫度(23±2)℃,相對(duì)濕度50%～70%,大鼠自由攝食飲水。

1.3.2 固定裝置制作及使用方法

(1)制作方法

將清潔后的舊白大褂衣料縫制成攤開(kāi)尺寸為50 cm×13 cm 的筒狀鼠衣,用剪刀在上面分別開(kāi)2個(gè)φ2.5 cm 和φ3.5 cm 的孔,用以掏出大鼠的前后肢,大小兩孔之間距離為17 cm,見(jiàn)圖1。

(2)使用方法

造模2 周后,篩選復(fù)制成功的KOA 大鼠模型進(jìn)行溫針灸治療[10-12],其中20 只大鼠采用常規(guī)的束縛法固定,20 只大鼠采用“鼠衣秋千式”固定。 每只大鼠溫針灸治療每日1 次,5 次為1 個(gè)療程,共2 個(gè)療程,療程間間隔2 d。

①鼠衣固定

操作者戴好手套,將大鼠置于粗糙的臺(tái)面上,左手抓住鼠尾向后輕拉,右手將鼠衣的一端口打開(kāi),利用大鼠喜暗喜鉆洞的習(xí)性,將其置于鼠衣口處,大鼠會(huì)自行鉆入其中,見(jiàn)圖2。 當(dāng)大鼠鉆到鼠衣中間時(shí),頭部則完全被鼠衣覆蓋。 左手隔著鼠衣迅速握住大鼠軀干,找到上肢與軀干連接處,拇食中三指從腹部方向夾持住大鼠兩側(cè)的肩胛骨,右手掏出大鼠的兩前肢。 在左手掌心與大鼠的軀干間留出縫隙,將尼龍?jiān)鷰目p隙中穿過(guò),圍繞鼠衣一周將大鼠前端固定,見(jiàn)圖3。 最后采用相似的方法固定大鼠身體后端,使其雙側(cè)后肢位于鼠衣外面。 完成上述操作后,觀察大鼠是否出現(xiàn)張口呼吸、反應(yīng)劇烈等情況,根據(jù)動(dòng)物反應(yīng)調(diào)整尼龍?jiān)鷰`的松緊。 針灸組大鼠體型體重相似,測(cè)量束縛大鼠所用尼龍?jiān)鷰@身體前端及后端一周所需的長(zhǎng)度,并用記號(hào)筆對(duì)新扎帶做標(biāo)記,有助于快速有效地固定下一只大鼠。 操作熟練之后1 人完成此固定過(guò)程約需要1 min。

②秋千式懸掛

圖1 鼠衣成品圖Figure 1 Finished design of rat’s coat

圖2 大鼠鉆進(jìn)鼠衣Figure 2 Rat getting into coat

取一段3 m 長(zhǎng)的布帶條,每隔8 cm 左右剪1 個(gè)小孔,用來(lái)放置S 型掛鉤以懸掛大鼠。 將布帶條兩端固定于實(shí)驗(yàn)室墻角兩側(cè)的墻壁,布帶條距離地面高度約為70 cm,以實(shí)驗(yàn)人員坐在凳子上操作舒適省力為宜。 在大鼠前肢和后肢對(duì)應(yīng)部位的鼠衣上分別開(kāi)孔,用S 型掛鉤懸掛于布帶條上對(duì)應(yīng)的孔內(nèi),使大鼠懸掛于布帶條上,處于“蕩秋千”微微擺動(dòng)的狀態(tài)。 借助S 形掛鉤調(diào)節(jié)大鼠身體前后端與布帶條之間距離,使大鼠頭部在上,身體與地面呈45 度傾斜,見(jiàn)圖4。 最后用長(zhǎng)尾夾收緊大鼠后肢根部的鼠衣,以充分暴露取穴部位。 操作熟練后1 人完成懸掛過(guò)程約需要30 S。

③溫針灸治療

大鼠針灸側(cè)腿部皮膚剃毛后,穴區(qū)用碘酒消毒后再以75%的乙醇脫碘,定位,毫針針刺腧穴,進(jìn)針深度為5～7 mm。 將艾炷置于針柄,點(diǎn)燃艾炷下端,每次30 min,進(jìn)針前在毫針上穿上隔熱紙板以防止溫針灸過(guò)程燙傷大鼠,見(jiàn)圖5。 治療過(guò)程多數(shù)大鼠處于閉目休息狀態(tài),針灸治療過(guò)程較為順利,見(jiàn)圖6。 治療結(jié)束后,取針和隔熱紙板,出血部位按壓止血、消毒。 剪開(kāi)尼龍?jiān)鷰?解開(kāi)大鼠的束縛,將其放回鼠籠。

圖3 固定大鼠Figure 3 Rat being fixed

圖4 秋千式懸掛Figure 4 Swinging rats

1.3.3 “鼠衣秋千式”固定法與束縛法的比較

從完成操作所需實(shí)驗(yàn)人員數(shù)量、單只大鼠固定所需時(shí)間、大鼠在固定及溫針灸治療時(shí)的反應(yīng)等方面比較“鼠衣秋千式”固定法與束縛固定法。

圖5 溫針灸治療Figure 5 Needle warming moxibustion treatment

圖6 溫針灸治療中的大鼠Figure 6 Rat in needle warming moxibustion treatment

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,以P＜0.05 時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同固定方法固定單只大鼠所需實(shí)驗(yàn)人員數(shù)量及時(shí)間的對(duì)比

完成大鼠固定和治療所需實(shí)驗(yàn)人員數(shù)量以及固定單只大鼠所需時(shí)間如表1 所示。 可見(jiàn),與束縛組相比,采用“鼠衣秋千式”法1 人即可完成固定和溫針灸治療;固定單只大鼠所需時(shí)間顯著減少(P＜0.01)。

2.2 溫針灸治療中不同固定方法組大鼠的反應(yīng)對(duì)比

溫針灸治療過(guò)程,不同固定方法組大鼠的反應(yīng)見(jiàn)表2。 “鼠衣秋千式”固定組有2 只大鼠在首次綁縛時(shí)候出現(xiàn)了較激烈的反應(yīng),占實(shí)驗(yàn)組大鼠總數(shù)的比例為10.00%,在隨后的9 次固定操作中,其應(yīng)激反應(yīng)逐漸減弱。 束縛組有7 只大鼠在操作中出現(xiàn)了反應(yīng)激烈、呼吸急促、燙傷等情況,所占比例為35.00%。 “鼠衣秋千式”固定組大鼠未出現(xiàn)攻擊咬傷操作人員情況,而束縛組大鼠在操作中有掙脫束縛、攻擊操作人員行為;“鼠衣秋千式”固定組大鼠在整個(gè)溫針灸2 個(gè)療程治療中,未見(jiàn)燙傷和死亡,有2 只大鼠出現(xiàn)掉針情況,而束縛組中則有12 只大鼠出現(xiàn)了掙扎掉針情況,占比高達(dá)60.00%,有6 只大鼠在捆綁或治療過(guò)程中死亡,占比達(dá)30.00%。

表1 不同方法固定單只大鼠所需人數(shù)、時(shí)間的對(duì)比( ,n=20)Table 1 Comparison of the number of people and time required for fixing a single rat by different methods

表1 不同方法固定單只大鼠所需人數(shù)、時(shí)間的對(duì)比( ,n=20)Table 1 Comparison of the number of people and time required for fixing a single rat by different methods

注:與束縛組(對(duì)照組)比較,*P＜0.01。Note. Compared with the bound rats Group (control group),*P＜0.01.

組別Groups完成操作所需人數(shù)(人)Number of people required單只大鼠固定時(shí)間(s)Time of fixing single rat鼠衣秋千式組Swinging rats bound with coat Group 1 89.20±3.93*束縛組Bound rats Group 2 110.85±15.64

表2 溫針灸治療中不同固定方法中大鼠的反應(yīng)對(duì)比(n=20)Table 2 Comparison of rats’ reactions in different fixation methods in needle warming moxibustion

3 討論

“鼠衣秋千式”大鼠溫針灸固定裝置制作簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便,只需1 個(gè)實(shí)驗(yàn)人員即可完成全部操作。與束縛固定法相比,該固定方法能減少所需操作人員數(shù)量,縮短固定單只大鼠的時(shí)間,有效地提高了實(shí)驗(yàn)效率;大鼠在固定以及溫針灸治療中的掙扎情況得到顯著緩解,掉針大鼠數(shù)量減少,未發(fā)生燙傷、咬傷操作人員等情況;鼠衣秋千式大鼠在2 個(gè)療程的溫針灸治療中未出現(xiàn)死亡情況。 “鼠衣秋千式”大鼠溫針灸固定法,能使大鼠治療部位穴位暴露充分,操作安全簡(jiǎn)便,且能提升工作效率,是一種較為適用于大鼠四肢部位溫針灸的固定方法。

理想的大鼠針灸固定方法應(yīng)具有取穴方便、無(wú)應(yīng)激刺激、操作安全簡(jiǎn)便等特點(diǎn),但就目前而言基本上難以完全做到。 為了盡可能降低固定對(duì)大鼠造成的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,課題組通過(guò)研究文獻(xiàn)、觀察大鼠習(xí)性,結(jié)合蕩秋千體驗(yàn),反復(fù)實(shí)踐改良后設(shè)計(jì)了“鼠衣秋千式”固定法。

與其他大鼠針灸固定方法相比,該法具有以下優(yōu)點(diǎn):第一、充分利用了大鼠喜歡黑暗環(huán)境和喜歡鉆洞的生活習(xí)性,在其頭部被鼠衣覆蓋的情況下進(jìn)行固定,有效地降低了大鼠被固定時(shí)的應(yīng)激反應(yīng),且鼠衣能緩沖和分散固定時(shí)產(chǎn)生的束縛力,防止了大鼠的窒息死亡;第二、被“秋千式”懸掛于布帶條上的大鼠由于四肢和趾部無(wú)著力點(diǎn)無(wú)法發(fā)力,在整個(gè)30 min 的溫針灸治療過(guò)程中比較安靜,多數(shù)大鼠處于閉目睡覺(jué)狀態(tài),配合度較高,切實(shí)避免了劇烈掙扎導(dǎo)致的燙傷、攻擊操作人員等情況發(fā)生,保證了針灸時(shí)效的穩(wěn)定性;第三、大鼠四肢部位穴位暴露充分,便于治療。 此方法既適合于單純針刺治療,也適用于溫針灸治療;第四、鼠衣尺寸可調(diào)整,固定裝置適用范圍較廣,不僅適用于各種體型的大鼠,還可用于小鼠、豚鼠等動(dòng)物;第五、實(shí)驗(yàn)人員熟練操作后固定和懸掛一只大鼠約需要1.5 min,且不需助手即可單獨(dú)完成,提升了工作效率。 另外,該固定方法還具有取材方便、制作簡(jiǎn)單、操作靈活等特點(diǎn)。

“鼠衣秋千式”大鼠溫針灸固定方法也存在一定的局限性,該法主要適用于動(dòng)物四肢部位取穴治療,而對(duì)于頭部、背部以及腹部的針灸治療,則需要對(duì)鼠衣進(jìn)行改良。 課題組將繼續(xù)改良和優(yōu)化該固定方法,以期操作更簡(jiǎn)便,適用治療的部位更廣,并進(jìn)一步降低固定時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)針灸療效的干擾作用。