李仙曉,李瑞生,李曉娟,晉 穎

(1.北京新里程腫瘤醫(yī)院,腫瘤內(nèi)科,北京 100161; 2.中國人民解放軍空軍總醫(yī)院,腫瘤內(nèi)科,北京 100142;3.中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心,臨床研究管理中心,北京 100039)

隨著環(huán)境污染的不斷加劇以及人口老齡化的趨勢不斷進(jìn)展,肺癌(lung cancer)仍是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。 分子靶向藥物(molecular targeting agents)是肺癌的主要治療策略之一,但目前分子靶向藥物主要用于肺腺癌(lung adenocarcinoma, LAC)為代表的非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer, NSCLC)的治療,而多來源于氣管鱗狀上皮的肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma, LSCC)尚無明確的分子靶向藥物[2]。 因此,研究和發(fā)現(xiàn)適用于LSCC 的分子靶向藥物,不僅有助于拓展LSCC 治療的策略,同時(shí)也能夠加深對分子靶向藥物的認(rèn)識。

另一方面,隨著疾病進(jìn)展LSCC 腫瘤組織體積不斷增大易于引起支氣管狹窄或阻塞性肺炎等,常見的治療策略是外科手術(shù)切除等開放性手術(shù)治療策略[3]。 射頻消融治療(radiofrequency ablation,RFA)是一種介入治療策略,能夠在精確毀損/消融腫瘤組織的同時(shí)最大限度的保護(hù)腫瘤組織周圍的正常組織(即癌旁組織:para-tumortissues)免受損傷[4],這使得RFA 成為LSCC 治療的理想策略:RFA一方面能夠直接消融LSCC 組織以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用,同時(shí)也能保護(hù)通過直接銷毀LSCC 腫瘤組織以維系呼吸道的正常組織結(jié)構(gòu)并直接緩解LSCC 組織占位引起的支氣管狹窄或阻塞性肺炎。 已有研究表明,RFA 聯(lián)合分子靶向藥物治療有助于實(shí)現(xiàn)更好地有效抗腫瘤效果的同時(shí),規(guī)避各自的不良反應(yīng)。

分子靶向藥物安羅替尼(Anlotinib)已被應(yīng)用于NSCLC 治療[5]。 為拓展我們對LSCC 的分子靶向治療的認(rèn)識并利用動(dòng)物模型探索RFA 對LSCC 的抗腫瘤作用,本研究首先檢測了LSCC 的動(dòng)物模型,在此基礎(chǔ)上檢測了LSCC 對Anlotinib 的敏感性,最終發(fā)現(xiàn)Anlotinib 能夠上調(diào) RFA 對 LSCC 腫瘤組織的殺傷作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選 60 只雌性 SPF 級 BALB/c 裸鼠,4 周齡,體重13～14 g。 由斯貝福(北京)生物科技有限公司提供[SCXK(京)2016-0002];飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK(軍) 2017-0016]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用以及研究方案通過了解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(IACUC-2017-019)。 在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵循3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利。

1.2 主要試劑與儀器

患者來源LSCC 組織(5 例)來自LSCC 外科手術(shù)的切除標(biāo)本;DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Thermo 公司產(chǎn)品;分子靶向藥物純品安羅替尼(Anlotinib,產(chǎn)品編號為S8726)購買自美國Selleck公司;RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qPCR試劑盒購買自美國ABI 公司;吸入麻醉劑(異氟烷,isoflurane)購自深圳瑞沃德公司;甲狀腺消融針(貨號UniBlate 700-103587 17G)購自RITA 公司;有機(jī)溶劑 二 甲 亞 砜 (DMSO)、 吐 溫 80、 聚 乙 二 醇(PEG400)均為國藥集團(tuán)北京公司產(chǎn)品;手術(shù)器械和材料均由本實(shí)驗(yàn)室保存。 qPCR 儀(美國ABI 公司,ABI-7500 型號。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Anlotinib 藥物工作液的配制

首先稱取Anlotinib 的藥物純品粉末,再使用有機(jī)溶劑二甲亞砜(DMSO)、吐溫80 以及聚乙二醇(PEG400)等對藥物進(jìn)行充分溶解。 進(jìn)一步使用生理鹽水進(jìn)行稀釋,最終獲得動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用的Anlotinib 溶液(其中DMSO 終濃度不超過1‰、吐溫80 終濃度以及PEG400 終濃度不超過2‰)[6]。

1.3.2 qPCR

手術(shù)切除獲得的30 對成對標(biāo)本(外科手術(shù)切除、氣管鏡切除的LSCC癌旁非腫瘤標(biāo)本)LSCC 腫瘤組織、癌旁組織依據(jù)ABI 公司提供的說明書提取組織中的RNA 樣本(total RNA samples)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qPCR 實(shí)驗(yàn),確定組織標(biāo)本中Anlotinib 的作用靶標(biāo)及相關(guān)信號通路目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。其中qPCR 實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕虮磉_(dá)水平的定量方法為SYBR Green 染色法(2-△△CT法)[7-8],具體以作為內(nèi)參(loadingcontrol)的β 肌動(dòng)蛋白(β-Actin)為標(biāo)準(zhǔn),確定各目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平[9-10]。 結(jié)果顯示為相對表達(dá)水平(目標(biāo)基因相對于β-Actin 的倍數(shù)[folds])繪制的散點(diǎn)圖。 qPCR 引物(5’→3’)與文獻(xiàn)[11]相同。 對于E-Cadherin 的相對表達(dá)水平(相對倍數(shù)/relative folds)的計(jì)算方法為對照組E-Cadherin表達(dá)水平為單位1,Anlotinib 治療組E-Cadherin 表達(dá)水平/對照組 E-Cadherin 表達(dá)水平即為 ECadherin 的相對表達(dá)水平。

1.3.3 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

將添加有20% FBS 的DMEM 在超凈臺中裝入滅菌的50 mL 離心管中(每管中約20 mL),再收集手術(shù)切除的LSCC 腫瘤組織。 進(jìn)一步在超凈臺中以滅菌的手術(shù)器械修整腫瘤組織獲得組織微塊(以精密天平進(jìn)行稱量,使得各個(gè)組織微塊的重量在2 mg左右)。 裸鼠麻醉后,在裸鼠皮下接種上述獲得的組織微塊,具體方法為:以異氟烷對裸鼠進(jìn)行吸入麻醉,再使用眼科鑷鈍性分離小鼠腹股溝附近皮膚以暴露出腹股溝附近裸鼠下肢內(nèi)側(cè)的股靜脈,使用眼科鑷將前一步驟敘述的LSCC 腫瘤組織微塊接種至股靜脈附近使LSCC 組織貼附在股靜脈表面以形成皮下腫瘤組織。 由于腫瘤組織活性良好且接種方式利于腫瘤細(xì)胞生長(LSCC 組織貼附在股靜脈表面為LSCC 的生長提供了良好的條件),在裸鼠體內(nèi)都能夠形成了皮下腫瘤組織。 本研究中共建立了5 個(gè)利用患者來源的LSCC(Patient-derived cell,PDC)建立的裸鼠皮下腫瘤模型,命名為PDC1(PDC No. 1)、PDC2(PDC No. 2)、PDC3(PDC No. 3)、PDC4(PDC No. 4)以及PDC5(PDC No. 5),在此基礎(chǔ)上對于Anlotinib 治療以及RFA 治療方法:

(1)對于Anlotinib 單獨(dú)作用實(shí)驗(yàn):在裸鼠接種LSCC 組織微塊后待小鼠接種LSCC 組織時(shí)的傷口愈合良好后,對裸鼠進(jìn)行口服灌胃給藥,給予動(dòng)物Anlotinib(隔日灌胃一次),此時(shí)Anlotinib 的劑量分別為:3、2、1、0.5、0.2 mg/kg。 待治療 10 次左右(約3 周)后,收集腫瘤組織,依據(jù)腫瘤重量、腫瘤體積計(jì)算Anlotinib 作用于LSCC 的抑制率,同時(shí)收集腫瘤組織以qPCR 檢測Anlotinib 對腫瘤組織中EMT 相關(guān)因子表達(dá)的影響;選取Anlotinib 自身無明顯細(xì)胞毒性而對LSCC 細(xì)胞EMT 有明確抑制活性的作用劑量進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn);

(2)對于RFA 聯(lián)合Anlotinib 共同作用實(shí)驗(yàn)共分四組,每組6 只動(dòng)物:在將LSCC 腫瘤組織接種裸鼠皮下后,經(jīng)過2 ～3 周左右的生長(這一期間對動(dòng)物進(jìn)行定期觀察[每3 日使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤組織體積一次,依據(jù)長軸×短軸×短軸/2 計(jì)算腫瘤體積])后,LSCC 組織微塊能夠在裸鼠皮下部位形成腫瘤組織(此時(shí)體積約為1500 ～2000 mm3),此時(shí)選取24 只動(dòng)物隨機(jī)分為4 組,①對于未治療組,LSCC在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行正常生長,不對動(dòng)物進(jìn)行任何干預(yù);② Anlotinib 單純治療組:對裸鼠進(jìn)行口服灌胃給藥,給予動(dòng)物 Anlotinib(隔日灌胃一次),此時(shí)Anlotinib 的劑量分別為0.5 mg/kg(Anlotinib 自身無明顯細(xì)胞毒性而對LSCC 細(xì)胞EMT 有明確抑制活性的作用劑量);③ 對于RFA 單獨(dú)治療:依據(jù)Xie等[4]描述的方法,使用甲狀腺消融針對皮下腫瘤組織進(jìn)行RFA 處理(具體RFA 條件為55-60℃,消融2 min);④ 對于RFA 聯(lián)合Anlotinib 治療:對皮下腫瘤組織進(jìn)行RFA 治療后 [(2)部分步驟 ③方法],再通過口服灌胃給予Anlotinib 治療[(2)部分步驟②方法];依據(jù)系列時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積繪制腫瘤生長曲線,確定 RFA、Anlotinib、RFA + Anlotinib 對LSCC 在裸鼠皮下生長的抑制作用,依據(jù)腫瘤生長曲線的曲線下面積(area under the proliferationcurves)確定不同組的整體抑制活性。 裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中,腫瘤組織的體積(Volumes)計(jì)算公式為:腫瘤長軸長度×腫瘤短軸長度×腫瘤短軸長度/2[9]。藥物作用的抑制率為:(對照組腫瘤生長曲線的曲線下面積-治療組腫瘤生長曲線的曲線下面積)/對照組腫瘤生長曲線的曲線下面積×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Anlotinib 對LSCC 的抗腫瘤活性檢測

qPCR 結(jié)果顯示了在LSCC 患者來源腫瘤組織中(PDTs)Anlotinib 作用靶標(biāo)(包括系列受VEGFR、PDGFR 等體酪氨酸蛋白激酶;MAPK、PI3K/AKT 通路主要信號分子)的表達(dá)水平(見圖1),上述因子在30 例LSCC PDTs 中均有表達(dá),且表達(dá)量在LSCC 組織中均顯著高于在癌旁組織(成對標(biāo)本中的癌旁非腫瘤組織標(biāo)本)。 這表明Anlotinib 可能對LSCC 具有殺傷作用。 進(jìn)一步結(jié)果顯示(見圖2),Anlotinib能有劑量依賴抑制LSCC 在裸鼠皮下的成瘤作用。進(jìn)一步檢測了Anlotinib 對LSCC 在裸鼠皮下形成的腫瘤組織中,EMT 相關(guān)因子表達(dá)的影響。 結(jié)果如圖2、表 1 和表 2 所示,0.5 mg/kg 劑量的 Anlotinib 其自身對LSCC 的細(xì)胞毒性較弱,但是能夠在LSCC 腫瘤組織中上調(diào)細(xì)胞上皮特征標(biāo)志物E-Cadhrin 的表達(dá)、下調(diào)間質(zhì)特征標(biāo)志物N-Cadherin、Vimentin 的表達(dá)水平。 因此,選取0.5 mg/kg 劑量的 Anlotinib 進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 Anlotinib 能夠上調(diào) RFA 對 LSCC 腫瘤組織的殺傷作用

圖1 分子靶向藥物作用靶標(biāo)在肺鱗癌/癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá)檢測Figure 1 Endogenous expression of RTKs and protein kinases in lung squamous cell carcinoma or the non-tumor tissues

結(jié)果如圖3 所示,將LSCC 腫瘤組織微塊接種裸鼠皮下形成腫瘤組織;在此基礎(chǔ)上 RFA 處理LSCC 腫瘤組織后,LSCC 皮下腫瘤的生長速度明顯減緩,0.5 mg/kg 劑量的Anlotinib 其自身對LSCC 的細(xì)胞毒性較弱,但能夠顯著增強(qiáng)RFA 對LSCC 在裸鼠皮下生長的抑制作用,此時(shí)腫瘤組織的生長不僅出現(xiàn)了生長抑制,RFA 聯(lián)合安羅替尼治療組腫瘤組織逐漸萎縮。 結(jié)果顯示為各組LSCC 形成皮下腫瘤組織的照片(圖3A),各組腫瘤組織的生長曲線(圖3B),上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)因子在腫瘤組織中的表達(dá)檢測(E-Cadherin C、N-Cadherin D 以及Vimentin E),以及依據(jù)生長曲線的曲線下面積計(jì)算所得的抑制率(表3)。 這表明,Anlotinib 聯(lián)合RFA治療能夠增加LSCC 對RFA 的敏感性。

3 討論

目前,肺癌相關(guān)分子靶向藥物以及研究工作的熱點(diǎn)仍然主要是作用于 EGFR 等以易瑞沙(Gefitinib,吉非替尼)為代表的小分子蛋白激酶抑制劑,而對LSCC 的相關(guān)研究不足[2]。 盡管現(xiàn)有分子靶向藥物的廣泛應(yīng)用能夠顯著延長患者生存期、改善患者的生存質(zhì)量但是隨著治療的進(jìn)行,患者易于出現(xiàn)藥物耐受[10]。 為克服這些問題,以Anlotinib為代表的新型分子靶向藥物被應(yīng)用于NSCLC 治療[3]。 與 Gefitinib 不 同, Anlotinib 是 作 用 于VEGFR、PDGFR 等的多靶標(biāo)蛋白激酶抑制劑[3]。全球多中心臨床試驗(yàn)的結(jié)果認(rèn)為Anlotinib 能夠有效發(fā)揮對NSCLC 的抗腫瘤作用并為患者帶來新的希望,但是目前LSCC 的分子靶向治療嚴(yán)重滯后,也未能因此足夠重視。 為解決這一問題,本研究首先發(fā)現(xiàn) LSCC 組織中 VEGFR、PDGFR 等 Anlotinib 的作用靶標(biāo)有明確表達(dá)這一重要研究線索,在此基礎(chǔ)上建立了LSCC 相關(guān)腫瘤模型并探索研究了Anlotinib對LSCC 的抗腫瘤活性。 結(jié)果表明,Anlotinib 對LSCC 在裸鼠皮下生長也有明確的抗腫瘤活性,Anlotinib 有望作為LSCC 的分子靶向藥物,這不僅有重要的研究意義同時(shí)也有望為患者帶來新的福音。

表1 安羅替尼對肺鱗癌組織皮下成瘤的抑制活性Table 1 Inhibitory effect of Anlotinib on subcutaneous tumorigenesis of lung squamous cell carcinoma

表2 安羅替尼上調(diào)肺鱗癌組織中E-Cadherin 表達(dá)水平Table 2 Treatment of Anlotinib enhanced the expression level of E-Cadherin in subcutaneous tumor tissues formed by lung squamous cell carcinoma cells

表 3 RFA、Anlotinib、RFA 聯(lián)合 Anlotinib 對 LSCC腫瘤組織的抑制率Table 3 Inhibition rates of RFA, Anlotinib, RFA +Anlotinib on LSCC cells’ subcutaneous growth

圖2 安羅替尼對肺鱗癌組織皮下成瘤的抑制活性Note. A, Pictures of tumor tissues. B, Tumor volumes. C, Tumor weights.Figure 2 The inhibitory effect of Anlotinib on subcutaneous tumorigenesis of lung squamous cell carcinoma

圖3 安羅替尼能夠上調(diào)射頻消融RFA 對肺鱗癌裸鼠皮下腫瘤組織Note. A, Pictures of tumor tissues. B, Tumor growth curve. C, Expression level of E-cadherin. D, Expression level of N-Cadherin. E,Expression level of Vimentin.Figure 3 Anlotinib can upregulate RFA of lung squamous cell carcinoma in nude mice

進(jìn)一步,LSCC 的治療主要是手術(shù)切除治療,但是胸腔的開放式手術(shù)會(huì)給患者帶來很大損傷[12]。以射頻消融(RFA)為代表的新興的介入治療策略能夠?qū)崿F(xiàn)對臟器腫瘤病灶的微創(chuàng)與精準(zhǔn)治療,目前主要應(yīng)用在進(jìn)展期HCC 相關(guān)治療[4],而在LSCC 中的應(yīng)用尚無報(bào)道。氣管鏡等相關(guān)診療技術(shù)的進(jìn)展使得肺部介入治療策略能夠得以應(yīng)用并實(shí)現(xiàn)介入的全肺抵達(dá)[13],因此氣管鏡與 RFA 聯(lián)合策略在LSCC 治療有良好的應(yīng)用前景:在有效和直接消融堵塞呼吸道、氣管、支氣管的LSCC 組織并盡可能減少對呼吸道組織的損傷作用。 但另一方面,RFA 治療也存在諸多挑戰(zhàn):(1)RFA 治療的能量和治療溫度不能無限增高,可能會(huì)存在不完全消融的情況;(2)RFA 一方面能夠發(fā)揮對LSCC 組織的殺傷作用,同時(shí)也有可能誘導(dǎo)LSCC 組織的 EMT 作用,引起LSCC 的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移作用。 本研究選取了較為溫和的RFA 條件(50℃～60℃,2 min),并輔以 Anlotinib治療。 結(jié)果顯示,Anlotinib 能夠發(fā)揮對RFA 的增敏作用,顯著加強(qiáng)RFA 對LSCC 在裸鼠皮下的增殖租用。 同時(shí),Anlotinib 能夠抑制 RFA 誘導(dǎo)的 LSCC 組織的EMT 作用。 因此,本研究不僅揭示了Anlotinib能夠應(yīng)用于LSCC 治療,同時(shí)也建立了LSCCRFA 的研究模型,為今后的進(jìn)一步研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

同時(shí),本研究在技術(shù)上也具有重要意義:(1)目前肺癌常用的研究模型:以A549(肺腺癌)、H460(大細(xì)胞肺癌) 為代表的細(xì)胞系的組織來源以NSCLC 為主,而LSCC 細(xì)胞系很少,同時(shí)長期使用、體外培養(yǎng)的現(xiàn)有細(xì)胞系與患者體內(nèi)的差異也在近年引起重視[14],因此本研究建立的LSCCPDCs 具有重要意義,為LSCC 相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ);(2)裸鼠皮下腫瘤模型易于觀察與操作,易于進(jìn)行經(jīng)皮穿刺的 RFA 處理 LSCC 腫瘤組織;同時(shí) RFA、Anlotinib 治療的效果也能夠依據(jù)腫瘤體積變化、腫瘤重量定量分析;(3)與氣管、支氣管等原發(fā)部位的腫瘤體積相當(dāng)、可比性強(qiáng),同時(shí)本研究的結(jié)果顯示,RFA 聯(lián)合Anlotinib 處理LSCC 腫瘤組織后腫瘤組織逐漸生長停滯和萎縮,這也為進(jìn)一步奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

致謝:感謝中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心介入科謝輝博士、副主任醫(yī)師在裸鼠RFA 實(shí)驗(yàn)中給予的指導(dǎo)和幫助!