沈文娟，王 磊，薛星星，韓啟春，姚志芳，何江波，吳國(guó)芳*，吳 森*

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

多巴胺受體1(dopamine receptor D1，DRD1)是一種典型的G蛋白偶聯(lián)受體，對(duì)胚胎早期發(fā)育起著決定性作用，特別是神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)育[1]。DRD1在鵝的心、腎、腸、肌肉、脂肪、垂體、下丘腦、子宮、輸卵管等組織廣泛表達(dá)[2]。王翠等[3]以10個(gè)鴨品種為研究對(duì)象，對(duì)DRD1基因突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR-SSCP分析，發(fā)現(xiàn)DRD1變異位點(diǎn)與鴨的繁殖性狀、產(chǎn)蛋、脂肪代謝存在顯著相關(guān)；徐海平[4]研究發(fā)現(xiàn)DRD1及DRD2基因與開產(chǎn)日齡極顯著相關(guān)；白優(yōu)等[5]對(duì)江香豬DRD1基因多態(tài)性開展研究并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究了DRD1基因在不同品種豬中的多態(tài)性差異；Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)DRD1基因C681T突變與鴨產(chǎn)蛋體重顯著相關(guān)，而內(nèi)側(cè)杏仁核中DRD1水平的變化可以引起草原田鼠性行為變化[7]。在通過GWAS研究蛋雞胚胎發(fā)育相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)DRD1的SNPs(single nucleotide polymorphisms)可能與蛋雞的蛋品質(zhì)有關(guān)[8]，敲除DRD1基因后雞的攻擊性行為顯著降低[9]。DRD1 G123A的SNP與匈牙利黃雞的體重、蛋品質(zhì)有關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)肉雞DRD1 C201T、A208G、A255G處的SNP與性成熟顯著相關(guān)[11]；通過對(duì)多巴胺受體基因多態(tài)性與雞繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析，G1073A與300日產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡顯著相關(guān)[12]。櫻桃谷鴨、興義鴨DRD1 T189C、T507A的SNP與體重、體斜長(zhǎng)、胸深等性狀顯著相關(guān)[13]，且與血清總蛋白、球蛋白、白蛋白、白/球比、低密度脂蛋白及肌胸pH24h和剪切力顯著相關(guān)[14]。目前對(duì)DRD1的研究大多數(shù)集中在人和禽類中，而關(guān)于DRD1和豬相關(guān)性狀的研究報(bào)道較少。

豬的DRD1基因定位于豬第16號(hào)染色體，全長(zhǎng)4 168 bp，包含兩個(gè)外顯子區(qū)域，參考序列為GeneBank No.：NC_010458.4。其蛋白(GeneBank No.：NP_001116580.1)由446個(gè)氨基酸組成，存在糖基化和多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)等功能性結(jié)構(gòu)域，多巴胺主要與多巴胺受體結(jié)合發(fā)揮作用，進(jìn)而引起動(dòng)物相應(yīng)生理變化[15]。青海八眉豬作為八眉豬的高原類群，具有產(chǎn)仔數(shù)高，母性好的優(yōu)點(diǎn)。因此，結(jié)合DRD1前期的功能性研究，運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)豬DRD1基因進(jìn)行多方位功能分析，檢測(cè)青海八眉豬DRD1所有外顯子片段的SNPs，并將其與相關(guān)生產(chǎn)、繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為青海八眉豬的分子輔助選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗(yàn)所用333頭純繁八眉豬母豬來自青海省互助八眉豬原種育繁場(chǎng)，試驗(yàn)豬群養(yǎng)殖背景一致、體重接近、健康狀況良好、三代以內(nèi)無親緣關(guān)系、經(jīng)產(chǎn)2胎次以上。采集耳組織，使用天根組織DNA 試劑盒(Tangen，北京)提取DNA，-20 ℃保存待用。

1.2 生長(zhǎng)性狀、繁殖性狀測(cè)定

測(cè)定并記錄青海八眉豬生長(zhǎng)性狀：利用軟尺及測(cè)杖測(cè)定并記錄體長(zhǎng)、體高、胸圍、臀圍，背膘厚(獸用背膘儀(B超)測(cè)量)，數(shù)據(jù)測(cè)定3次；繁殖性狀：經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù)統(tǒng)計(jì)平均產(chǎn)仔數(shù)，記錄并統(tǒng)計(jì)兩側(cè)乳頭平均數(shù)，具體方法參考李良華等[16]的研究。

1.3DRD1生物特征信息分析

NCBI檢索豬及相關(guān)常見模式哺乳動(dòng)物序列：人(NP_000785.1，Homosapiens)、小鼠(NP_034206.1，Musmusculus)、大鼠(NP_036678.3，Rattusnorvegicus)、牛(NP_776467.1，Bostaurus)、豬(NP_001116580.1,Susscrofa)、斑馬魚(NP_001129448.1，Daniorerio)。使用MEGA X軟件(version 10.1.7)，采用MUCLE法進(jìn)行多序列比較；使用泊松模型以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，研究物種進(jìn)化關(guān)系[17]，結(jié)果采用CLC Sequence view (version 8.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。通過MEME suit(version 5.1.1)在線軟件(http://meme-suite.org/)檢測(cè)多物種DRD1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中功能性motif結(jié)構(gòu)[18]，其結(jié)果以TBtools(version 0.6735)進(jìn)行可視化。使用STRING數(shù)據(jù)庫(version 11.0)(https://string-db.org/)挖掘豬DRD1及直接互作蛋白的互作作用，挖掘DRD1主要功能[19]，STRING網(wǎng)絡(luò)互作結(jié)果以Cytoscape(version 3.7.2)進(jìn)行可視化[20]；功能富集結(jié)果以R(version 3.6.3)的dplyr(version 0.8.5)進(jìn)行整理，以cowplot(version 1.0.0)和ggplot2(version 3.3.0)進(jìn)行可視化；功能富集條目少于20條直接輸出，多于20條的僅輸出Top20。采用NCBI CDD(Conserved Domains)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)保守性結(jié)構(gòu)域檢測(cè)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)[21]，其結(jié)果以TBtools進(jìn)行可視化。

1.4DRD1目的基因PCR擴(kuò)增及SNP檢測(cè)

針對(duì)豬DRD1基因全部外顯子區(qū)域(NM_001123108.1)，使用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，引物序列見表1。

隨機(jī)挑選30個(gè)DNA樣品，吸取等量DNA組成混合樣本。以DNA混合樣本為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系20.0 μL，包括：2×Primer STAR Max Premix 10.0 μL，ddH2O 7.4 μL，上游、下游引物各(10 pmol/μL) 0.8 μL、模板 DNA( 50 ng/μL )1.0 μL。循環(huán)方案為95 ℃，5 min(預(yù)變性)；94 ℃ 30 s(變性)；55.0 ℃ 30 s(退火)，具體見表1；72 ℃ 1 min(延長(zhǎng))；72 ℃ 10 min(終延伸)，4 ℃保存。符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)物交由上海美吉生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過DNA STAR software (version7.1) 軟件進(jìn)行序列比對(duì)及分析。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，逐個(gè)對(duì)333個(gè)樣本中存在SNP片段進(jìn)行檢測(cè)。

在專教中，進(jìn)門設(shè)有一塊黑板，便于老師上課時(shí)指導(dǎo)學(xué)生教學(xué)使用，黑板前上方有投影，為老師的信息化教學(xué)提供了很好的硬件設(shè)備，教室后角落放有物品架，可供學(xué)生放置個(gè)人物品，桌間有擋板與鄰座相隔形成的私密空間，為學(xué)生提供一定的私人空間，專教的門屬于密碼防盜門，使得專教安全性提高，專教出門為陽臺(tái)走廊，為學(xué)生在學(xué)習(xí)繁忙中提供了一個(gè)緩解放松的地方，走廊外墻設(shè)有展示墻，可將學(xué)生優(yōu)秀作品進(jìn)行展示，營(yíng)造一個(gè)濃厚的學(xué)習(xí)氛圍，專教內(nèi)雖未設(shè)置大面積的落地玻璃，但開有許多窗，仍具有很好的采光效果。

表1 DRD1引物及PCR擴(kuò)增信息Tab.1 DRD1 primer and amplification of PCR

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

在鑒定SNP的基礎(chǔ)上，關(guān)聯(lián)八眉豬生長(zhǎng)性狀、繁殖性狀，采用SPSS (version 26)軟件統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)結(jié)果，以P<0.05為差異顯著水平；一般線性模型參考吳森等[22]研究：表型值=群體均值+標(biāo)記基因型效應(yīng)+年齡效應(yīng)+胎次效應(yīng)+隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬DRD1蛋白及其近緣物種序列特征

多序列比對(duì)結(jié)果顯示，豬DRD1蛋白與人、大鼠、小鼠、牛、斑馬魚等動(dòng)物的DRD1在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上存在大量保守性片段(圖1)；在二級(jí)結(jié)構(gòu)上存在大量顯著的保守性motif結(jié)構(gòu)(圖2)；在三級(jí)結(jié)構(gòu)上存在一個(gè)相同的PHA03087保守性功能結(jié)構(gòu)域(圖3)。DRD1在豬及其近緣物種中結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，所以各物種DRD1功能可能相似。

圖1 豬及其近緣物種DRD1一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)Fig.1 Comparison of primary structure of DRD1 between pigs and related species

圖2 豬及其近緣物種DRD1二級(jí)結(jié)構(gòu)中保守性motif比對(duì)Fig.2 Comparison of conservative motif in the secondary structure of DRD1 between pigs and related species

圖3 豬及其近緣物種DRD1三級(jí)結(jié)構(gòu)中保守性結(jié)構(gòu)域比對(duì)Fig.3 Comparison of conserved domains in the tertiary structure of DRD1 between pigs and related species

2.2 豬DRD1蛋白遺傳進(jìn)化分析

圖4結(jié)果顯示，在物種遺傳進(jìn)化方面，豬DRD1蛋白與牛進(jìn)化關(guān)系最近，與斑馬魚最遠(yuǎn)。

圖4 豬DRD1蛋白進(jìn)化分析Fig.4 Evolutionary analysis of DRD1 protein of pigs

STRING網(wǎng)絡(luò)互作結(jié)果顯示，豬DRD1蛋白與CRH、NPS、ADCY4、ADCY9等10個(gè)蛋白有很強(qiáng)的相互調(diào)控作用(圖5)。由圖6可知，通過KEGG富集發(fā)現(xiàn)，豬DRD1蛋白主要與晝夜節(jié)律、慢性嗎啡中毒、松弛素信號(hào)通路、γ-氨基丁酸能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等有關(guān)。通過GO富集發(fā)現(xiàn)，豬DRD1蛋白在參與生物進(jìn)程BP(biological process，BP)方面，主要在G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、腺苷酸環(huán)化酶激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、細(xì)胞信號(hào)傳遞、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等活動(dòng)中發(fā)揮作用；在分子功能MF(molecular function，MF)方面，DRD1蛋白主要在G蛋白偶聯(lián)受體活性、激素活性、神經(jīng)肽激素活性、分子功能調(diào)節(jié)劑等方面發(fā)揮作用；在參與細(xì)胞組成CC(cellular component，CC)方面，DRD1蛋白主要在胞外區(qū)、質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成成分、細(xì)胞組分等活動(dòng)中發(fā)揮作用。

圖5 豬DRD1蛋白直接互作蛋白Top10Fig.5 Top10 direction interaction protein of DRD1 protein of pigs

圖6 豬DRD1蛋白及直接互作蛋白(Top50)主要功能富集Fig.6 Main functional enrichment of DRD1 protein of pigs and direct interaction protein (Top50)

2.4DRD1基因外顯子區(qū)域SNP檢測(cè)

測(cè)序結(jié)果如圖7所示，在DRD1基因外顯子區(qū)域檢測(cè)到1個(gè)SNP。但在青海八眉豬DRD1基因的1159處存在2種突變類型，分別標(biāo)記為Type1(g.1159C>T)和Type2(g.1159C>G)。

圖7 青海八眉豬DRD1外顯子SNP位點(diǎn)檢測(cè)圖Fig.7 Detection of SNP of DRD1 exon of Qinghai Bamei pigs

2.5DRD1基因多態(tài)性分析

由表2可知，在DRD1基因中，Type1與Type2均有3種基因型CC、CT、TT和CC、CG、GG；A、T和C、G兩種等位基因頻率分別為71.4%、28.6%和87.7%、12.3%；第一種突變型g.1159C>T，經(jīng)哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)卡方檢驗(yàn)處于平衡狀態(tài)，通過長(zhǎng)期進(jìn)化和選擇，群體遺傳未受到人工干預(yù)和遺傳漂變，選擇壓力??；Ho觀測(cè)雜合度基本和He期望雜合度具有差異，處于低雜合程度，SNP中突變影響力中等；有效等位基因數(shù)Ne分別為1.691、1.275，即在理想群體下，一個(gè)基因座上產(chǎn)生該突變相同的純合率分別需要1.691、1.275個(gè)等位基因；突變位點(diǎn)PIC值0.25G的突變型個(gè)體較少，PIC<0.25，屬于低度多態(tài)性，突變程度小，選擇壓力大。

表2 DRD1在八眉豬中的基因型和突變頻率分布Tab.2 Genotype and mutation frequency distribution of DRD1 in Bamei pigs

2.6DRD1基因SNP關(guān)聯(lián)生產(chǎn)性能、繁殖性能分析

由表3可知，DRD1基因兩種突變型，由于Type2型突變個(gè)體較少，主要探究Type1型突變。Type1型突變與產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)，突變純合型產(chǎn)仔數(shù)最多，可達(dá)10.2頭；其突變純合型TT產(chǎn)仔數(shù)顯著高于野生純合CC和雜合CT型(P<0.05)，在后續(xù)分子標(biāo)記輔助育種中可以考慮將DRD1作為八眉豬產(chǎn)仔性狀相關(guān)的候選基因，g.1159C>T型為主要選育基因型類型。而該突變與八眉豬的體尺等生長(zhǎng)性狀無顯著關(guān)系(P>0.05)。

表3 DRD1基因SNP位點(diǎn)與性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Correlation analysis of SNP sites of DRD1 gene and traits

表3(續(xù))

3 討論與結(jié)論

DRD1是兒茶酚胺及苯乙胺家族的一類化學(xué)物質(zhì)，作為一種G蛋白偶聯(lián)受體蛋白，在機(jī)體垂體、下丘腦、子宮、輸卵管等組織中廣泛存在[1,2]，可直接影響胚胎早期發(fā)育[1,8]。在一些成熟機(jī)體中，DRD1的SNP與性成熟有關(guān)[11]，在朱麗莉等[12]的研究中，DRD1與雞的產(chǎn)蛋量、就巢日齡等繁殖性狀呈顯著或極顯著相關(guān)。本研究通過對(duì)DRD1基因多態(tài)性與八眉豬生長(zhǎng)性狀、產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)DRD1基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)。白優(yōu)等[5]通過對(duì)香江豬種DRD1外顯子區(qū)多態(tài)位點(diǎn)分析，證實(shí)在哺乳動(dòng)物間該基因序列差異較小，說明DRD1基因序列具有相對(duì)保守性。動(dòng)物的性成熟和其他繁殖行為與機(jī)體的激素水平有直接關(guān)系。垂體前葉分泌的糖蛋白卵泡刺激素(follicle stimulating hormone) 與顆粒細(xì)胞上的受體相互作用，刺激雌性動(dòng)物卵巢卵泡的成熟和分化，可影響二花臉豬的產(chǎn)仔數(shù)[24]。從DRD1的主要表達(dá)組織垂體、下丘腦、子宮、輸卵管等來看，其可能影響機(jī)體對(duì)激素的分泌，刺激性器官，從而影響繁殖性能。另外，機(jī)體內(nèi)分泌的平衡也可能導(dǎo)致繁殖性能的差異。例如，芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor)可介導(dǎo)免疫系統(tǒng)的平衡、細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖等多種體內(nèi)生物學(xué)過程，與產(chǎn)仔數(shù)也存在相關(guān)性[23]。

本研究通過對(duì)八眉豬DRD1基因一個(gè)突變位點(diǎn)的兩種突變型與繁殖性能多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)Type1(g.1159C>T)為主要突變類型。Type1型突變純合型TT產(chǎn)仔數(shù)顯著高于野生純合CC和雜合CT型，Type2(g.1159C>G)型突變數(shù)量較少，推測(cè)可能是檢測(cè)群體為人工選育型群體，由于突變導(dǎo)致繁殖性能下降或?qū)ε咛ビ兄滤佬?yīng)，在長(zhǎng)期選育過程中被逐漸淘汰。檢測(cè)群體為青海省互助八眉豬原種育繁場(chǎng)的種豬群體，在長(zhǎng)期選育過程中，由于突變個(gè)體生產(chǎn)、繁殖性能低下逐漸淘汰機(jī)制，突變雜合子個(gè)體太過稀少或未包含純合個(gè)體而被淘汰。關(guān)于DRD1基因多態(tài)性對(duì)母豬產(chǎn)仔數(shù)影響的報(bào)道有限，且所研究的SNP位點(diǎn)數(shù)量較少，研究結(jié)果不盡一致。本試驗(yàn)基于DRD1基因的多態(tài)性檢測(cè)及關(guān)聯(lián)分析，初步推斷DRD1多態(tài)性對(duì)產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響，但由于品種及具體性狀不同而有一定差異，也可能是因?yàn)槿斯みx擇在一定情況下內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡遺傳力逐步積累的結(jié)果。DRD1基因的具體效應(yīng)如能進(jìn)一步篩查確認(rèn)，并在不同豬群中研究檢測(cè)，將有助于深入了解DRD1基因與繁殖性狀的相關(guān)性，使其在育種工作中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，經(jīng)多年人工選育，DRD1基因在青海八眉豬中存在多態(tài)性，其g.1159C>T為主要突變型。g.1159C>T與青海八眉豬的產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)，其TT型群體表現(xiàn)出最高的產(chǎn)仔數(shù)，平均為10.2頭。DRD1可作為候選基因，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的群體選育，為青海八眉豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供理論參考。