尹亞麗，劉 穎,2，李世雄,2*

(1.青海大學畜牧獸醫(yī)科學院,青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016；2.省部共建三江源區(qū)高寒草地生態(tài)教育部重點實驗室,青海大學,青海 西寧 810016)

高寒草甸是在寒冷的環(huán)境下由青藏高原隆升后，特化形成的一種高寒植被類型，其植被物種豐富，群落結構簡單，草層低矮，草質優(yōu)良，為良好的天然牧場。近年來，受全球氣候變化與人類活動的共同影響[1]，加之不合理的放牧管理和家畜數(shù)量與草地資源的不當匹配，使得草地嚴重超載，草地環(huán)境日益惡化，大面積的優(yōu)良草地出現(xiàn)不同程度退化[2]。草地退化，地面覆蓋度降低，土壤侵蝕、水土流失，草地生產力下降，生態(tài)系統(tǒng)結構和功能嚴重受損，其不僅阻礙了牧區(qū)社會、經濟和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，還嚴重威脅到長江流域和黃河中下游地區(qū)的生態(tài)平衡與人類的生存發(fā)展[3]。補播是退化草地快速恢復治理的有效途徑之一[4-5]，通過播種適宜草種來調整草地群落結構，加強優(yōu)良牧草競爭優(yōu)勢，以提高草地生產力和優(yōu)質牧草比例，調節(jié)草地植被物種組成，提高草層高度，擴大草地植被蓋度。

土壤細菌作為土壤微生物中含量最多、豐度最高的類群，具有最為豐富的遺傳多樣性，促進營養(yǎng)物質釋放、有機質的分解，參與C、N等物質循環(huán)過程[6-7]，在土壤生態(tài)過程中有著不可或缺的地位。然而，微生物生命周期短暫，其結構和功能對生存的微環(huán)境極其敏感，可對環(huán)境變化做出快速反應[6,8]。退化草地補播修復，原有的土壤微環(huán)境受到擾動，土壤質量和養(yǎng)分循環(huán)發(fā)生根本改變，逐漸形成了與之相適應的土壤微生物群落結構并發(fā)揮其相應功能[9]。近五年來，有關學者對土壤中微生物的原位生存狀態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法很難全面地估計土壤中微生物群落多樣性，從土壤中簡單提取、培養(yǎng)的方法只能反映極少數(shù)微生物的信息[10]，隨著高通量基因檢測技術的發(fā)展與成熟，為生態(tài)系統(tǒng)中微生物的研究提供了新的手段。鑒于此，本研究采用高通量基因檢測技術，對補播措施下高寒草甸土壤細菌群落特征進行研究，明確土壤細菌群落組成、結構及功能對補播措施的響應規(guī)律，以期為退化草地恢復治理提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于青海省果洛藏族自治州瑪沁縣大武鎮(zhèn)(100°12′49.6″ E，34°27′51.9″ N，海拔約3 740 m)，屬典型高原大陸型氣候，干旱、多風，太陽輻射強，日照時間短，晝夜溫差大。年均氣溫-3.9 ℃，最冷月平均氣溫為-12.6 ℃，最熱月平均氣溫為9.7 ℃，冷季長、暖季短。年降水量513.2～542.9 mm，主要集中于5—9月，年蒸發(fā)量2 471.6 mm。牧草生長季約150 d，全年無絕對無霜期。草地為高寒矮嵩草(Kobresiahumili) 草甸，退化草地主要植物有莎草科、禾本科、菊科、龍膽科、薔薇科、豆科及雜類草等；土壤為高山草甸土。

1.2 試驗方法

參照馬玉壽等[11]的分類標準，依據草地植被覆蓋度、可食牧草及毒害草比例和草場質量等指標，將草地評定為中度退化草地。2006年利用青海草地早熟禾對中度退化草地進行補播處理，播種量3.75 kg/hm2，并以150 kg/hm2施用尿素，補播后未進行后續(xù)改良。2016年5月，在中度退化(Moderate-degradation，MD；MD-1和MD-2分別代表該草地0～10 cm和10～20 cm土層)及補播草地(Reseeding，RS；RS-1和RS-2分別代表該草地0～10 cm和10～20 cm土層)，各劃定4個試驗小區(qū)為重復，每小區(qū)面積約200 m2。2017年8月，采用蛇形取樣法，以直徑3.5 cm的根鉆在各小區(qū)采集0～10 cm 和10～20 cm土樣，每小區(qū)5～8鉆分層混合為1個土樣，過2 mm篩，撿除枯物、石粒及植物根系等，裝入自封袋，4 ℃運回實驗室，充分混勻后裝入10 mL離心管，干冰運輸至廣州基迪奧生物科技有限公司進行Metagenomic測序，測序和生物信息服務在Illumina PE250平臺完成。

采用HiPure Soil DNA Mini Kit ( Magen公司，中國廣州) 提取土壤DNA。取2 μL DNA樣品，采用NanoDrop微量分光光度計(NanoDrop 2000，Thermo Fisher，USA)測定核酸的吸光度，檢測核酸的純度。采用瓊脂糖(1% agarose)凝膠電泳檢測核酸樣品的完整性和蛋白污染程度。取2 μL DNA樣品，采用Qubit熒光定量(Qubit 3.0，Thermo Fisher，USA)檢測每一個樣品的DNA濃度，并根據濃度計算樣品DNA總量。采用微生物Marker基因高通量測序評估土壤細菌群落結構和多樣性，細菌檢測區(qū)為16S rRNA基因的V3+V4區(qū)。

測序得到的Raw reads通過過濾、Tags拼接、過濾、去嵌合體，對N50、N90 Tags由長到短加和，最終在有效Tags樣本中隨機選取(8.0～9.2)×104Tags開展OTU (operational taxonomic units)聚類分析。用Uparse軟件對所有樣品的全部有效Tags序列聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTUs結果，并計算出每個OTU在各個樣品中的Tags絕對豐度和相對信息。采用Silva (Quast et al，2013)數(shù)據庫進行物種注釋(設定置信度的閾值為0.8～1.0)，并根據注釋信息統(tǒng)計每個樣品在各個分類水平(界、門、綱、目、科、屬、種)上的Tags序列數(shù)目?；贠TUs計數(shù)統(tǒng)計，利用Bray-Curtis距離系數(shù)分析土壤細菌群落差異，采用Faprotax數(shù)據庫對土壤細菌生態(tài)功能進行預測。

1.3 測定指標

(1)Chao1指數(shù)在生態(tài)學中用來估計物種總數(shù)。Chao1=Sobs+F1(F1-1)/2(F2+1)，式中：Sobs表示樣本中觀察到OTU數(shù)目，F(xiàn)1是樣本中數(shù)量只為1的OTU數(shù)目(稱為Singleton)，F(xiàn)2是樣本中數(shù)量只為2的OTU數(shù)目(稱為Doubleton)。

1.4 數(shù)據處理

采用Excel 2010進行數(shù)據整理及單因素(one-way ANOVA)和T檢驗(α=0.05)，Spass 17.0進行Wilcoxon秩和檢驗，采用R 3.5.2進行細菌物種組成、群落多樣性及PCoA分析；利用Excel 2010和R 3.5.2軟件作圖，圖表中數(shù)據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 補播對土壤細菌物種組成的影響

本試驗從補播及退化草地土壤樣品中讀取的細菌序列屬于10個門，包括浮霉菌門(Planctomycetes) 、酸桿菌門 (Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)(圖1)。

由圖1可知，浮霉菌門、變形菌門、疣微菌門、酸桿菌門和放線菌門為退化及補播草地土壤優(yōu)勢細菌，五者在土壤細菌中占比超過75%。0～10 cm土層，浮霉菌門、變形菌門、疣微菌門、酸桿菌門和放線菌門優(yōu)勢細菌相對豐度在退化及補播草地分別為15%和30%、22%和17%、13%和 15%、23%和16%、10%和7%。T檢驗結果顯示，酸桿菌門、硝化螺旋菌門和厚壁菌門細菌相對豐度在退化草地和補播草地間差異顯著(P<0.05)；10～20 cm土層，上述五者優(yōu)勢細菌在退化及補播草地分別為18%和27%、17.4%和16.7%、11%和 13%、20%和19%、9%和6%。兩草地門水平土壤細菌T檢驗結果顯示，綠彎菌門、硝化螺旋菌門和擬桿菌門細菌豐度在兩草地間顯著差異。即補播后優(yōu)勢細菌浮霉菌門、疣微菌門相對豐度升高，酸桿菌門、變形菌門和放線菌門相對豐度降低，補播改變了草地土壤細菌物種組成，且同一草地不同土層土壤細菌物種存在差異。

圖1 補播及退化草地土壤細菌門水平相對豐度Fig.1 Relative abundance of soil bacteria phylum level in reseeding and degraded grassland

2.2 補播對土壤細菌群落多樣性的影響

表1為補播對草地土壤細菌群落多樣性的變化。由表1可知，退化及補播草地0～10 cm土壤細菌多樣性指數(shù)均高于10～20 cm。在0～10 cm土層，補播后草地土壤細菌Simpson指數(shù)顯著升高(P<0.05)，而土壤細菌Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)無明顯變化；在10～20 cm土層，補播草地土壤細菌Shannon和Simpson指數(shù)指數(shù)均顯著升高，其中Shannon指數(shù)升高0.34，而Chao1指數(shù)在兩草地間無顯著差異(P>0.05)。即補播對草地表土層土壤細菌多樣性影響較小，而對下土層土壤細菌多樣性影響較大。

表1 補播對退化草地土壤細菌群落多樣性的影響Tab.1 Effects of reseeding on the diversity of soil bacterial community in degraded grassland

2.3 補播對土壤細菌群落結構的影響

采用Bray距離對草地土壤細菌OTU進行主坐標分析(PCoA)，由圖2可知，PCo1對土壤細菌群落結構差異的解釋度為46.45%，PCo2的解釋度為16.73%，兩軸解釋度總和達63.18%。Wilcoxon秩和檢驗結果顯示，同一草地不同土層土壤細菌群落結構無顯著差異(P<0.05)。在0～10 cm土層，退化草地與補播草地間土壤細菌群落結構差異極顯著(P<0.01)；在10～20 cm土層，不同草地土壤細菌群落結構無明顯差異(P=0.06>0.05)。即補播改變了草地表土層土壤細菌群落結構。

圖2 補播對退化草地土壤細菌群落結構的影響Fig.2 Effects of reseeding on the structure of soil bacterial community in degraded grassland

2.4 補播對土壤細菌功能結構的影響

采用Faprotax對補播草地和退化草地土壤細菌群落進行生態(tài)功能預測，在退化及補播草地共注釋功能菌62種，其中0～10 cm土層有47種在不同草地間表現(xiàn)差異；10～20 cm土層有59種在不同草地間表現(xiàn)差異(P<0.05)。對豐度前十的功能菌進行分析，由圖3、圖4可知，化能異養(yǎng)(包含有氧化能異養(yǎng))、硝化作用、亞硝酸鹽氧化及硫代謝作用細菌在草地土壤中起主要功能調節(jié)作用。T檢驗結果顯示，在0～10 cm土層，硝化作用、亞硝酸鹽氧化作用、硫及硫化物呼吸作用和動物寄生共生作用細菌在退化及補播草地間差異顯著(P<0.05)；在10～20 cm土層，化能異養(yǎng)作用、有氧化能異養(yǎng)、硝化作用、亞硝酸鹽氧化作用、動物寄生共生作用、芳香族化合物降解作用及硝酸鹽還原作用細菌在退化及補播草地間差異顯著(P<0.05)。

注：*表示兩草地間差異顯著，下同。化能異養(yǎng)(chemoheterotrophy)；有氧化能異養(yǎng)(aerobic chemoheterotrophy)；硝化作用(nitrification)；亞硝酸鹽氧化(aerobic nitrite oxidation);氨氧化作用(aerobic ammonia oxidation);硫化物呼吸(respiration of sulfur compounds)；硫呼吸作用(sulfur respiration)；動物寄生-共生作用(animal parasites or symbionts)；芳香族化合物降解(aromatic compound degradation)；尿解作用(ureolysis)；下同。圖3 補播對0～10 cm土層土壤細菌群落功能結構的影響Fig.3 Effects of reseeding on the functional structure of soil bacterial community in 0～10 cm soil layer

注：硝酸鹽還原(nitrate reduction)。圖4 補播對10～20 cm土層土壤細菌群落功能的影響Fig.4 Effects of reseeding on the functional structure of soil bacterial community in 10～20 cm soil layer

3 討論與結論

土壤微生物是土壤中一切生態(tài)功能的媒介[12]，作為草地地下生態(tài)系統(tǒng)最大的資源庫，是土壤有機質和土壤養(yǎng)分等在土壤和大氣圈雙向循環(huán)和轉化中的主要推動力，其生命周期短，對生存的微環(huán)境十分敏感，能對土壤生態(tài)變化和環(huán)境脅迫做出快速反應[13-15]。本研究表明，退化高寒草甸補播后草地土壤細菌物種組成發(fā)生明顯改變，補播草地土壤浮霉菌門和疣微菌門細菌相對豐度升高，酸桿菌門、變形菌門和放線菌門細菌相對豐度降低。補播對草地表土層土壤細菌多樣性影響較小，而對下土層細菌多樣性影響較大。造成此結果的原因可能是因補播改變了退化草地地上植被物種組成，土壤中有機物質輸入及土壤性質發(fā)生相應變化，加之土壤生物競爭、對物理和生物環(huán)境的擾動適應性等因素的共同作用[16-17]，導致土壤細菌物種組成及群落多樣性發(fā)生變化。

同一草地不同土層間土壤細菌群落結構差異不顯著；但是在同一土層不同草地間土壤細菌群落結構表現(xiàn)顯著差異，補播改變了草地0～10 cm土層細菌群落結構?；墚愷B(yǎng)(包含有氧化能異養(yǎng))、硝化作用、亞硝酸鹽氧化及硫代謝作用細菌在草地土壤中起主要功能調節(jié)作用，補播改變了退化草地土壤細菌功能結構。包明等[18]研究指出硝化作用、化能異養(yǎng)作用、氨氧化作用、亞硝酸鹽氧化及硝酸鹽還原作用功能類細菌在土壤中具有較高的豐度，這與本研究結果基本一致。補播后草地土壤亞硝酸鹽氧化作用細菌顯著減少，這一結果可能與微生物物種組成改變有關，新的優(yōu)勢物種與相關功能物種存在種間協(xié)同-競爭；同時與土壤性質變化有關，土壤性質的變化引致微生物生存環(huán)境改變[19-21]。此外，地上植被組成的改變可能會影響某些土壤微生物群落的發(fā)展和種群組成[22]，土壤凋落物投入的改變導致微生物底物有效性的變化。Yang等[15]研究也指出土壤微生物群落功能結構的變化主要受地上植被、土壤碳氮比和銨態(tài)氮含量的控制。由此可知補播改變了退化高寒草甸土壤細菌群落及功能結構。