簡瑩娜，張學(xué)勇，李秀萍，趙海龍，王光華，王戈平，馬利青*

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.青海省西寧市野生動物園，青海 西寧 810001)

水貂病毒性腸炎是由水貂腸炎病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)感染引起的急性、烈性、高度接觸性傳染病，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。其病原MEV是細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒屬(Parvovirus)的無囊膜單股負(fù)鏈DNA病毒，基因組全長約5 kb，基因組包括2個開放閱讀框，其中一個編碼調(diào)控病毒復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，另一個編碼組成衣殼結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2[2-3]。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在MEV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用，NS2在MEV的DNA擴(kuò)增調(diào)控和結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄和組裝中發(fā)揮作用[2]；結(jié)構(gòu)蛋白VP1在MEV的復(fù)制和組裝過程中起重要作用，VP2是MEV主要的衣殼蛋白，誘導(dǎo)感染動物產(chǎn)生MEV的特異性中和抗體，同時在致病性和遺傳進(jìn)化方面發(fā)揮重要作用[3-5]。1949年Schofield[6]在加拿大報道了水貂病毒性腸炎的暴發(fā)，1952年Wills[7]成功分離到了該病的病原MEV，之后水貂病毒性腸炎相繼在美國，丹麥、挪威、芬蘭、瑞典、英國、中國和日本等國發(fā)生[2，3，8]。目前，水貂病毒性腸炎已成為危害我國養(yǎng)貂業(yè)的重要疫病之一，在我國的遼寧省(大連)、山東省(濰坊、威海、煙臺、青島)、吉林省、河北省都有病原的鑒定分析[2]，我國學(xué)者在水貂感染MEV方面做了大量研究[8-10]，但對雪豹感染MEV的檢測鑒定分析尚無報道。

根據(jù)雪豹臨床癥狀、疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律、治療用抗生素?zé)o效等特征，本研究對雪豹源疑似感染MEV的雪豹糞便樣本進(jìn)行特異性診斷、鑒定，并對MEV的NS1基因進(jìn)行測序分析，為雪豹源MEV的生物學(xué)特性、疫苗防控等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

兩份雪豹腹瀉糞便樣本取自青海省西寧市野生動物園，置于采樣箱中送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測分析。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司；TIANamp Virus DNA/RNA Kit、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；引物合成及陽性質(zhì)粒測序均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，其他均為國產(chǎn)常規(guī)試劑。

主要儀器：PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、離心機(jī)、微量移液器等。

1.3 病毒基因組的提取

取1 g左右新鮮糞便加入0.5 mL滅菌PBS溶液中，反復(fù)凍融2次，12 000 g/min離心10 min，取上清液進(jìn)行病毒基因組提取，提取過程按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit說明書進(jìn)行。

1.4 PCR分子鑒定

依據(jù)參考文獻(xiàn)[9]中的引物對MEV進(jìn)行PCR分子生物學(xué)鑒定(表1)。擴(kuò)增反應(yīng)體系：Premix Taq 25.0 μL，上、下游引物(濃度10 μmol/L)各2.0 μL，模板DNA 3.0 μL，補(bǔ)充水18.0 μL 至PCR反應(yīng)體系為50.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、 55 ℃退火40 s(短片段)和56 ℃退火40 s(長片段)、72 ℃延伸20 s(短片段)和2 min(長片段)，各35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(電壓為恒壓120 V， 時間為35 min)，檢測完成后在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照。

表1 MEV分子鑒定所用引物Tab.1 Primers used for molecular identification of MEV

將長片段PCR陽性產(chǎn)物凝膠回收后按照連接試劑盒說明連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，然后挑取平板上單克隆菌落于液體培養(yǎng)基中，再經(jīng)PCR鑒定后將陽性質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序。

1.5 基因序列分析

PCR陽性質(zhì)粒(長片段)測序委托蘇州金唯智生物科技有限公司采用Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)峰圖分析后，在GenBank上采用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)方法進(jìn)行同源序列搜索，應(yīng)用MEGA 5.0軟件和Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在線軟件進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列同源性的分析。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

通過NCBI提供的BLAST在線搜索服務(wù)軟件獲取其他MEV的NS1基因序列。使用MEGA 5.0軟件的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建功能對這些基因序列進(jìn)行分析，選擇鄰近法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并使用自展值(bootstrap)檢驗(yàn)其可靠性，重復(fù)次數(shù)為2 000，分析不同分離株病毒間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR分子鑒定

利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取DNA后，對基于NS1基因短片段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增出約200 bp的目的片段(圖1a)；對基于NS1基因長片段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增出約2 000 bp的目的片段(圖1b)?；驍U(kuò)增片段大小與預(yù)期相符。

圖1 NS1基因兩個片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of two segments of NS1 gene

2.2NS1基因長片段PCR鑒定結(jié)果

對NS1基因長片段PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，再經(jīng)菌液PCR鑒定后將陽性質(zhì)粒送測序公司測序，鑒定結(jié)果如圖2所示。

圖2 質(zhì)粒pMD18-T-NS1基因(長片段)PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification of plasmid pMD18-T-NS1 geme(long fragment)

2.3 核苷酸序列同源性比較分析

由表2可知，將NS1基因長片段測序結(jié)果進(jìn)行在線BLAST序列比對，MEV-QH1與Genebank 中水貂腸炎病毒(登錄號：JX535284、KY094124)核苷酸序列高度同源(99.00%～99.75%)，MEV-QH2與Genebank 中水貂腸炎病毒(登錄號：JX535284、D00765)核苷酸序列高度同源(98.85%～99.65%)，由此表明檢測到的病毒為MEV。

2.4 氨基酸序列同源性比較分析

本研究克隆NS1基因長為2 007 bp，編碼668個氨基酸，與不同病毒株間氨基酸序列同源性為98.80%～100.00%(表3)；由表4 可知，對本研究克隆的毒株與其他株間NS1氨基酸非同義位點(diǎn)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)19個氨基酸位點(diǎn)存在變異，但不存在特異性變異位點(diǎn)(不存在與現(xiàn)有氨基酸序列完全不同的氨基酸位點(diǎn)，即突變位點(diǎn)在現(xiàn)有序列中均存在)，而MEV-QH1與MEV-QH2在350位(D(Asp)-N(Asn))、574位(I(Ile)-V(Val))和595位(Q(Gln)-H(His))存在3個變異位點(diǎn)。

表3 不同毒株間NS1氨基酸序列同源性的比較Tab.3 Comparison of amino acid sequence homology of NS1 among different strains

表4 不同毒株間NS1氨基酸非同義位點(diǎn)的比較Tab.4 Comparison of non synonymous amino acid sites of NS1

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

運(yùn)用MEGA 5.0軟件，基于NS1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可知，MEV-QH1和MEV-QH2聚在一個大的分支上，但并未聚在一個微小分支上；分離株MEV-QH1與中國山東分離株聚在一個微小分支上，分離株MEV-QH2與日本Abashiri株及中國L株聚在微小分支上。

圖3 基于NS1基因以鄰近法所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on NS1 gene by neighbour-joining method

3 討論與結(jié)論

本研究對雪豹源MEV-QH1/2進(jìn)行了分子鑒定，即對NS1基因進(jìn)行了克隆和序列測定，并比對分析了核苷酸和氨基酸序列的同源性。本次克隆的NS1基因序列2 007 bp，MEV-QH1/2與Genebank 中水貂腸炎病毒(登錄號：JX535284、KY094124、D00765)核苷酸序列高度同源(98.85%～99.75%)，編碼668個氨基酸，與不同病毒株間氨基酸序列同源性為98.80%～100.00%。據(jù)張海玲等[2]研究報道，MEV的NS1蛋白中有一個從389位氨基酸開始的長為150個氨基酸的保守區(qū)域，包含細(xì)小病毒的391-394GKRN高保守序列，其在細(xì)小病毒中的氨基酸保守性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他位點(diǎn)區(qū)域，由于此區(qū)域中具有解旋活性并與ATPase或GTPase相關(guān)的ATP或GTP結(jié)合位點(diǎn)，因此該保守區(qū)域?yàn)椴《綝NA復(fù)制所必需的。本研究中所克隆的NS1基因序列推導(dǎo)的氨基酸序列391-394保守序列未發(fā)生變異，同時在389-539位中的150個氨基酸序列，即細(xì)小病毒的高保守序列中MEV-QH1株和MEV-QH2株序列相同，未發(fā)生變異，但MEV-QH1株與MEV-SD8株512位處存在L(Leu)到S(Ser)的突變，MEV-QH2株與MEV-SD4株519位處存在K(Lys)到E(Glu)的突變，這兩處的突變是否對NS1蛋白功能產(chǎn)生影響有待于進(jìn)一步的研究。

基于NS1基因構(gòu)建的MEV系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，雪豹源MEV-QH1/2兩株并不聚在一個微小分支上，這兩株病毒間有3個氨基酸位點(diǎn)的突變，存在一定的株間遺傳變異，但MEV-QH1/2分離株并未與其他分離株形成微小分支，這可能與青藏高原地理環(huán)境或宿主相關(guān)，應(yīng)對雪豹源動物不同個體分離株之間的差異進(jìn)行分析，后續(xù)需采集更多的樣品進(jìn)行研究。

目前，水貂病毒性腸炎尚無特異性治療方法，進(jìn)行免疫接種是降低發(fā)病率和死亡率的有效手段。盧悅[11]研究報道， MEV變異株的發(fā)現(xiàn)和流行，導(dǎo)致水貂病毒性腸炎的防控依舊面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。因此，動物居住的屋舍一點(diǎn)要定期打掃通風(fēng)，用燒堿(氫氧化鈉)、福爾馬林、過氧乙酸等進(jìn)行消毒，從而有效減少疾病的傳播[12]。