司 誠，李宗仁，沈?qū)帠|

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院， 青海 西寧 810016)

鷹嘴豆(CicerarietinumL.)又名羊頭豆、桃豆、腦豆子等，屬豆科(Leguminosaes)鷹嘴豆屬(Cicer)，一年生的草本植物[1]。鷹嘴豆起源于亞洲西部、中東地區(qū)，主要分布在地中海沿岸、亞洲、美洲等，在中國的甘肅、新疆等地種植較多[2]。鷹嘴豆?fàn)I養(yǎng)成分全，籽粒含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪及豐富的脂肪酸等，具有解毒、養(yǎng)顏等多種功效，是一種可供糖尿病、高血糖患者和中老年人長期食用的低淀粉、高蛋白、純天然的食品[3-4]。目前，國內(nèi)有關(guān)鷹嘴豆的研究主要集中在對其所含營養(yǎng)成分提取、栽培技術(shù)、食品加工、藥用價值以及種子萌發(fā)等多個方面，其次在其抗鹽、引種等方面也有少數(shù)研究[5-7]。干旱作為影響植物生長的非生物因子之一，常常會引起植物對于干旱的不同響應(yīng)，如膜透性，脯氨酸含量等的變化。不同植物對于干旱的抵抗能力、復(fù)水后植物自身的補(bǔ)償效應(yīng)等都有所差異，鷹嘴豆根系發(fā)達(dá)，具有較強(qiáng)的耐旱性，而目前國內(nèi)外關(guān)于模擬干旱及復(fù)水對鷹嘴豆種子萌發(fā)及芽苗生長影響的研究鮮少報道。鑒于此，本研究采用PEG-6000模擬干旱的方法，研究鷹嘴豆種子萌發(fā)時抵制和忍耐滲透脅迫的生理生態(tài)機(jī)制，結(jié)果可為鷹嘴豆的抗性研究、灌溉栽培等提供基礎(chǔ)材料，同時為其在干旱地區(qū)育種、引種等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試鷹嘴豆種子由烏魯木齊市廣泰峰糖酒有限公司提供，產(chǎn)地為新疆維吾爾自治區(qū)木壘縣。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 PEG-6000干旱脅迫處理及種子萌發(fā)試驗

先將鷹嘴豆種子用0.5%高錳酸鉀消毒5 min，用蒸餾水沖洗干凈，分別以濃度為0%、5%、10%、15%、20% 的PEG-6000處理，0%即以蒸餾水處理，作為對照CK。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，于90 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，以2層濾紙作為發(fā)芽床。經(jīng)PEG-6000脅迫處理后，發(fā)芽的第5天，測定芽苗形態(tài)指標(biāo)和各項生理指標(biāo)。

1.2.2 復(fù)水試驗

各濃度的PEG-6000干旱脅迫5 d后，開始復(fù)水試驗，分別于復(fù)水1、3、5 d測鷹嘴豆芽苗生理指標(biāo)的變化。并在復(fù)水5 d時，觀測鷹嘴豆芽苗的形態(tài)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)測定[8]

萌發(fā)時滯(h)：即萌發(fā)開始時間，自萌發(fā)試驗開始到第1粒種子開始萌發(fā)所持續(xù)的時間。

發(fā)芽率(GR)=(5 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt),式中：Gt表示在第t天種子的發(fā)芽數(shù),Dt代表相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)(VI)=GI×S，式中：S為第5天測得的整株幼苗鮮重(g)。

1.3.2 芽苗形態(tài)指標(biāo)的測定

分別在干旱脅迫處理第5天及復(fù)水后第5天時測定芽苗形態(tài)，從各個培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取10株，洗凈并用吸水紙吸干水分，測定其最大根長(root length，RL)、芽長(bud length，BL)、鮮重(fresh weight，F(xiàn)W)等指標(biāo)。

1.3.3 生理指標(biāo)的測定

(1)游離脯氨酸(Pro)含量測定。脯氨酸含量用茚三酮比色法測定[9]，試驗前，制作脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=73.612 5x+0.412 7(R2=0.999 76，Y：脯氨酸濃度(μg/mL)，x：吸光值)，樣品用分光光度計在520 nm波長處測定吸光值。根據(jù)公式計算脯氨酸含量：脯氨酸含量(μg/g)=(脯氨酸濃度×3%磺基水楊酸用量)/樣品鮮重。

(2)丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量測定。丙二醛(MDA)含量測定參照Velikova的TBA(硫代巴比妥酸)檢測法[10]，其計算公式：MDA含量(μmol/g)=[6.452×(A532-A600)-0.559×A450]×Vt/(Vs×W)，式中：A為吸光值，Vt為提取液總體積(10 mL)，Vs為測定時提取液的體積(2 mL)，W為樣品重(g)。

(3)可溶性糖含量的測定。采用蒽酮法[11]測定可溶性糖含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=158.381 7x-2.503 5 (R2=0.996 7，Y：可溶性糖濃度(μg/mL)，x：吸光值)，測定時稱取試驗材料0.200 g左右，剪碎放入三角瓶內(nèi)加入25 mL沸水，將三角瓶放入水浴鍋沸水浴10 min，冷卻后過濾定容至50 mL。根據(jù)公式計算樣品中可溶性糖的含量：可溶性糖含量(μg/g)=(w×V1) /(V2×W)，式中：w為可溶性糖濃度(μg/mL)，V1為提取液體積(50 mL)，V2為測試液體積(2 mL)，W為樣品重(g)。

(4)可溶性蛋白質(zhì)含量測定。選用考馬斯亮藍(lán)G-250法[9]測定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)595 nm波長下測得的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液的吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=232.558x+0.279(R2=0.999 3，Y：蛋白質(zhì)濃度(μg/mL) ，x:吸光值)。根據(jù)公式計算樣品蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)含量(ug/g)=A×V1/(V2×W)，式中：A為蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)，V1為提取液總體積(10 mL)，V2為測定取用體積(0.1 mL)，W為樣品重(g)。

所有試驗結(jié)果均設(shè)3次重復(fù)，取平均后對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG-6000處理對于種子萌發(fā)的影響

不同濃度PEG-6000處理對鷹嘴豆種子萌發(fā)的影響如圖1所示，空白對照及PEG-6000濃度為5%和10%干旱脅迫處理的鷹嘴豆種萌發(fā)時滯為1 d，PEG-6000濃度為15%和20%干旱脅迫處理的種子萌發(fā)時滯為2 d，表明輕度干旱脅迫對鷹嘴豆種子的萌發(fā)時滯影響不大，而重度干旱脅迫會使種子的萌發(fā)時滯明顯延長。不同濃度PEG-6000處理的鷹嘴豆種子，同一天內(nèi)，隨著PEG-6000濃度的升高，發(fā)芽率逐漸降低，其中對照種子的發(fā)芽率明顯較高，并且發(fā)芽迅速整齊。較對照5%的輕度干旱脅迫對于鷹嘴豆種子發(fā)芽率的影響差異不大，兩者的曲線趨勢走向近乎相同，第1天發(fā)芽率較低，第2天種子吸水充足，發(fā)芽率明顯提高，隨著脅迫時間的延長，發(fā)芽率沒有顯著變化。PEG-6000濃度為10%的干旱脅迫對其發(fā)芽率的影響曲線與5%的相似，但發(fā)芽率在第3天以后近乎穩(wěn)定，相較于對照和5%，時間上有所滯后。PEG-6000濃度為15%的鷹嘴豆種子在第1天種子發(fā)芽率近乎為零，3 d后發(fā)芽率呈現(xiàn)直線的增長，4 d后發(fā)芽率趨于穩(wěn)定。20%的重度干旱對鷹嘴豆種子的發(fā)芽率影響較大，發(fā)芽第2天，其發(fā)芽率仍然只有3.33%，之后呈現(xiàn)緩慢的增長。

圖1 不同濃度PEG-6000處理對種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of PEG-6000 treatment on the seed germination rate

不同濃度PEG-6000處理第5天對鷹嘴豆種子發(fā)芽的影響如表1所示，經(jīng)過方差分析得到P=0.000 1<0.01。從發(fā)芽率來看，對照與PEG-6000濃度為5%干旱脅迫處理的鷹嘴豆種子發(fā)芽率無顯著性差異，與10%脅迫處理的鷹嘴豆種子發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)，與15%、20%重度干旱脅迫處理的鷹嘴豆種子發(fā)芽率存在極顯著差異(P<0.01)。從發(fā)芽指數(shù)來看，對照與PEG-6000濃度為5%、10%脅迫下的鷹嘴豆種子發(fā)芽指數(shù)沒有顯著性差異，與15%、20%重度脅迫處理的發(fā)芽指數(shù)有極顯著差異(P<0.01)，說明重度干旱下，鷹嘴豆種子的發(fā)芽能力以及種子活力都受到了極顯著抑制。從活力指數(shù)來看，各濃度處理間的種子活力指數(shù)都有顯著性差異(P<0.05)，其中對照和5%、5%和10%、10%和20%處理間的種子活力指數(shù)都有極顯著差異(P<0.01)。綜上可知，隨著PEG-6000濃度的升高，發(fā)芽指數(shù)受到極顯著抑制。

表1 不同濃度PEG-6000處理第5天對鷹嘴豆種子發(fā)芽的影響Tab.1 Effects of different concentrations of PEG-6000 treatment on the germination of Cicer arietinum L.seed on the 5th day

2.2 不同濃度PEG-6000處理及復(fù)水對芽苗生長的影響

不同濃度PEG-6000處理及復(fù)水對鷹嘴豆芽苗生長的影響如表2所示，在復(fù)水前干旱脅迫5 d時，不同濃度PEG-6000處理下，鷹嘴豆芽苗生長指標(biāo)都不同程度的受到了抑制，其根長、芽長、鮮重相較于對照都下降了，其中PEG-6000濃度為10%、15%、20%干旱脅迫處理的芽苗生長受抑情況較為明顯。不同濃度PEG-6000處理下的鷹嘴豆芽苗根長存在極顯著差異(P=0.000 3<0.01)，其中對照組芽苗的根長與5%處理相比無顯著性差異，但卻極顯著的高于10%、15%、20%處理。不同濃度PEG-6000處理下的鷹嘴豆芽苗芽長存在極顯著差異(P=0.000 1<0.01)，對照和5%處理的芽苗芽長極顯著地高于10%、15%和20%處理，10%處理的芽苗芽長又極顯著地高于15%和20%處理，但濃度為15%和20%的處理間，芽苗芽長沒有顯著差異。不同濃度PEG-6000處理下的鷹嘴豆芽苗鮮重存在極顯著差異(P=0.000 1<0.01)，對照的芽苗鮮重顯著高于10%、15%、20%處理，5%濃度處理又極顯著高于20%處理。

表2 不同濃度PEG-6000處理及復(fù)水對鷹嘴豆芽苗生長的影響Tab.2 Effects of different concentrations of PEG-6000 treatment and rehydration on thegrowth of Cicer arietinum L.sprout

在復(fù)水5 d后，各處理下的鷹嘴豆芽苗生長指標(biāo)都有了恢復(fù)性增長。其中5%處理經(jīng)過復(fù)水，鷹嘴豆芽苗生長狀態(tài)相對較好。復(fù)水5 d后的根長，經(jīng)過方差分析得到P=0.017 2<0.05，對照與5%、10%、15%處理的根長無顯著性差異，與20%處理有顯著性差異。復(fù)水5 d后的芽長，方差分析得到P=0.004 4<0.01，對照與濃度為5%處理存在極顯著性差異，與10%、20%處理的鷹嘴豆芽長之間均無顯著性差異，與15%的處理間存在顯著差異。復(fù)水5 d后的鷹嘴豆芽苗鮮重，方差分析得到P=0.013 2<0.05，5%處理的鷹嘴豆芽苗與10%脅迫處理有顯著差異，與15%、20%脅迫下的鷹嘴豆鮮重有極顯著差異。

2.3 不同濃度PEG-6000干旱脅迫及復(fù)水對鷹嘴豆芽苗生理指標(biāo)的影響

2.3.1 干旱脅迫對鷹嘴豆芽苗生理指標(biāo)的影響

在干旱脅迫第5 天時，不同濃度PEG-6000處理對鷹嘴豆芽苗各項生理指標(biāo)的影響(表3)。由表可知，不同濃度PEG-6000處理鷹嘴豆種子之后，隨著干旱脅迫程度的增加，脯氨酸含量逐漸增加，經(jīng)方差分析得到P=0.000 1<0.01。對照與各處理間均存在顯著或極顯著性差異，20%處理的鷹嘴豆芽苗中脯氨酸含量極顯著地高于其他處理，但濃度為5%處理和10%處理間沒有顯著差異。

表3 不同濃度PEG-6000處理對鷹嘴豆芽苗各項生理指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of different concentrations of PEG-6000 treatment on the physiologicalindexes of Cicer arietinum L.sprout

丙二醛含量隨著PEG-6000濃度的增加逐漸增加，經(jīng)方差分析得到P=0.002 6<0.01，可見各處理間的丙二醛含量存在極顯著差異，其中對照與各個處理間均有顯著或極顯著差異，20%處理的丙二醛含量極顯著地高于5%處理和對照，而濃度為5%處理和10%處理間沒有顯著差異。

可溶性糖含量隨著PEG-6000濃度的升高而逐漸增加，經(jīng)方差分析得到P=0.000 8<0.01，20%處理下的可溶性糖含量極顯著高于其他處理，對照與15%處理有顯著差異，5%和10%輕度干旱脅迫間沒有顯著差異。

蛋白質(zhì)含量測定中，隨著PEG-6000濃度的增加鷹嘴豆芽苗中蛋白質(zhì)含量無明顯變化，對照與各個處理間差異較小，經(jīng)方差分析后得到P=0.561 7>0.05，可見各處理間均無顯著差異。

2.3.2 干旱脅迫后復(fù)水對鷹嘴豆芽苗生理指標(biāo)的影響

不同濃度PEG-6000處理后進(jìn)行復(fù)水試驗，不同濃度PEG-6000干旱脅迫后復(fù)水時間對鷹嘴豆芽苗脯氨酸含量的多重比較如表4所示，不同濃度PEG-6000處理后的鷹嘴豆芽苗經(jīng)過復(fù)水1 d后，其脯氨酸含量隨著脅迫程度的增加呈升高趨勢，對照與10%、15%、20%處理均有極顯著差異(P<0.01)，但與5%處理無顯著性差異(P>0.05)。復(fù)水3 d后，20%處理與其他處理下的脯氨酸含量均有極顯著差異(P<0.01)。復(fù)水5 d后，隨著復(fù)水時間的延長，脯氨酸含量逐漸降低，各處理間脯氨酸含量差異減小。濃度為20%處理與對照、5%、10%處理的脯氨酸含量有極顯著差異(P<0.01)，與15%處理無顯著性差異(P>0.05)。

表4 不同濃度PEG-6000干旱脅迫后復(fù)水時間對鷹嘴豆芽苗脯氨酸含量的多重比較Tab.4 Multiple comparison of proline content in Cicer arietinum L.sprout with different concentrations of PEG-6000 and rehydration time

不同濃度 PEG-6000脅迫后復(fù)水不同時間對鷹嘴豆芽苗丙二醛、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的影響如表5所示。同一復(fù)水時間不同濃度處理的鷹嘴豆芽苗的丙二醛含量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量，經(jīng)方差分析得到P=0.063>0.05；P=0.849 9>0.05；P=0.692>0.05，即不同處理濃度間沒有顯著性差異。相同濃度處理不同復(fù)水天數(shù)，方差分析結(jié)果顯示P=0.165 4>0.05；P=0.096 5>0.05；P=0.088 3>0.05，即不同復(fù)水天數(shù)間丙二醛含量、可溶性糖含量、蛋白質(zhì)含量無顯著性差異。隨著復(fù)水天數(shù)的增加，丙二醛含量、可溶性糖含量逐漸恢復(fù)平穩(wěn)，蛋白質(zhì)含量隨著復(fù)水天數(shù)的增加，沒有明顯變化。

表5 不同濃度 PEG-6000脅迫后復(fù)水不同時間鷹嘴豆芽苗丙二醛、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量Tab.5 Malondialdehyde，soluble sugar and protein content of Cicer arietinum L.sprout with different concentrations of PEG-6000 stress and rehydration at different times

2.3.3 復(fù)水前后鷹嘴豆芽苗生理指標(biāo)的比較

PEG-6000處理后復(fù)水前后鷹嘴豆生理指標(biāo)比較如圖2所示。脯氨酸含量變化如圖2a，在不同濃度PEG-6000脅迫下，濃度越高，脯氨酸含量升高的越明顯，表明干旱脅迫使鷹嘴豆種子內(nèi)脯氨酸含量顯著增加；復(fù)水后，對于不同濃度的處理，脯氨酸含量會隨著復(fù)水天數(shù)的增加明顯下降，之后趨于平穩(wěn)；對照的脯氨酸含量變化相對較平穩(wěn)，變幅較??；由于PEG-6000濃度為20%干旱脅迫嚴(yán)重，復(fù)水后脯氨酸的下降速率會相對較緩。丙二醛含量變化如圖2b，復(fù)水前，隨著PEG-6000濃度的增加，丙二醛的含量逐漸增加，復(fù)水1 d后，10%、15%、20%處理下丙二醛的含量明顯下降，并在繼續(xù)復(fù)水后的幾天仍有下降趨勢。其中，重度干旱脅迫下，鷹嘴豆的丙二醛(MDA)含量下降明顯?？扇苄蕴呛孔兓鐖D2c，干旱脅迫處理后，鷹嘴豆中的可溶性糖含量和脅迫前相比呈明顯的上升趨勢，但在復(fù)水1 d后迅速回降?？扇苄蕴强烧J(rèn)為是植物遭受逆境傷害后重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。蛋白質(zhì)含量變化如圖2d，不同PEG-6000濃度處理后的鷹嘴豆種子在復(fù)水前后，蛋白質(zhì)沒有明顯的波動變化規(guī)律性。

圖2 不同濃度PEG-6000處理復(fù)水前后鷹嘴豆生理指標(biāo)比較Fig.2 Comparison of physiological indexes of Cicer arietinum L.before and after the rehydration with different concentrations of PEG-6000 treatment

3 討論與結(jié)論

干旱作為影響植物生長的重要非生物因子之一，常會引起植物的內(nèi)源物質(zhì)響應(yīng)，如膜透性、糖含量的變化，并且不同植物對于干旱的抵抗能力以及自身的補(bǔ)償效應(yīng)等都有所差異。本研究通過對鷹嘴豆種子萌發(fā)時抵制和忍耐滲透脅迫的生理生態(tài)機(jī)制研究結(jié)果表明,5%的輕度干旱脅迫對于鷹嘴豆的萌發(fā)時滯、發(fā)芽率近乎無影響，而15%、20%重度干旱脅迫下，鷹嘴豆種子的發(fā)芽期明顯滯后，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等都明顯降低，根長、芽長、鮮重等生長指標(biāo)明顯受抑，嚴(yán)重影響種子的活力、萌發(fā)幼苗的健壯程度。隨著脅迫程度的增加，脯氨酸、丙二醛和可溶性糖的含量均逐漸增加，20%的高濃度處理極顯著地高于低濃度處理。但是隨著脅迫程度的增加，鷹嘴豆芽苗中蛋白質(zhì)的含量值基本保持恒定。

復(fù)水后不同PEG-6000處理的鷹嘴豆芽苗生長指標(biāo)都有了恢復(fù)，芽長、鮮重根長曲線都恢復(fù)的較為平緩，其中濃度為5%的輕度干旱脅迫經(jīng)過復(fù)水，鷹嘴豆芽苗生長狀態(tài)較為突出。復(fù)水后脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量較復(fù)水前大幅度下降，但丙二醛和可溶性糖含量各處理間及不同復(fù)水時間之間均無顯著差異。脯氨酸不同處理濃度間及復(fù)水不同時間均存在顯著差異。

鷹嘴豆具有極強(qiáng)的耐旱能力，不需施肥和特殊管理，是干旱半干旱地區(qū)理想的蛋白質(zhì)來源[12]。本試驗結(jié)果顯示，鷹嘴豆芽苗中蛋白質(zhì)含量明顯較高，干旱脅迫對于鷹嘴豆蛋白質(zhì)含量沒有太大影響。而徐銀萍等[14]研究表明脅迫時間越長，大麥籽粒中蛋白質(zhì)的含量會顯著增加，這可能是因為鷹嘴豆的抗旱性比較強(qiáng)，PEG-6000濃度為20%的干旱脅迫下，并不會造成鷹嘴豆芽苗中蛋白質(zhì)含量的顯著增加?；蛘哂捎邡椬於狗N子萌發(fā)，種子中可溶性蛋白質(zhì)含量隨著種子的萌發(fā)被消耗，同時干旱脅迫蛋白質(zhì)含量又會相應(yīng)增加，從而造成蛋白質(zhì)含量變化沒有較大規(guī)律性。但是具體原因還有待通過進(jìn)一步研究來確定。

干旱脅迫后對其復(fù)水能夠使植物的各項生理功能逐漸得到恢復(fù)，可以在一定程度或范圍內(nèi)彌補(bǔ)干旱脅迫對于植物所造成的傷害[13]。復(fù)水后的植株會產(chǎn)生相應(yīng)的補(bǔ)償修復(fù)機(jī)制，使植物細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)的合成、分解代謝的比例等發(fā)生變化，合成的酶的活性得到提高，各值均可以恢復(fù)到或者接近對照處理水平，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝逐漸趨于正常水平。本研究結(jié)果顯示，芽苗中可溶性糖含量、脯氨酸、丙二醛等生理指標(biāo)隨著復(fù)水時間的延長逐漸向?qū)φ账交謴?fù)。本研究明晰了鷹嘴豆種子萌發(fā)和芽苗生長時抵制和耐滲透肋迫的生理生態(tài)機(jī)制，為鷹嘴豆的抗性研究、灌溉栽培等提供研究基礎(chǔ)，同時為其在干旱地區(qū)育種、引種等提供理論依據(jù)。