彭廣操，喬利杰，李彬，王建茹，孫陽，朱明軍

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州450046

高血壓是一種以動脈血壓持續(xù)升高為表現(xiàn)的進(jìn)行性“心血管綜合征”［1］，常導(dǎo)致腦卒中、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心?。?、心力衰竭、左心室肥厚、心房顫動、終末期腎病等臨床疾患的發(fā)生［2］。為減少心血管風(fēng)險及防止其他并發(fā)癥的出現(xiàn)，提高高血壓患者的壽命及生活質(zhì)量，臨床早期干預(yù)非常重要。隨著青年高血壓患病率的升高，預(yù)防關(guān)口更應(yīng)前移［2］。

高血壓屬中醫(yī)“眩暈”“頭痛”范疇。病位在清竅，涉及肝、脾、腎三臟，風(fēng)、火、痰、瘀、虛是重要的致病因素。該病多因工作壓力大、飲食不節(jié)、久坐不動、肥胖、熬夜等導(dǎo)致痰濕阻遏，升降失常，痰火氣逆，上犯清竅，瘀血停著，痹阻清竅而發(fā)病。據(jù)此理論并結(jié)合多年臨床經(jīng)驗，創(chuàng)制了具有“祛濕化痰、清熱瀉火、活血化瘀”功效的復(fù)方鬼針草顆粒。該藥由鬼針草30 g，茵陳30 g，夏枯草20 g，丹參15 g，玉米須30 g，大黃5 g組成?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鬼針草能夠抑制腎素和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性［3］、增加NO的產(chǎn)生，減少內(nèi)源性縮血管活性物質(zhì)血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）和內(nèi)皮素－1（endothelin－1，ET－1）的釋放［4］，從而降低血壓、逆轉(zhuǎn)左心室肥厚、改善心功能［5］。茵陳通過降低ACE活性，減少AngⅡ的產(chǎn)生，增強血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)和抑制RAS同源基因家族成員A（RhoA）表達(dá)實現(xiàn)降低血壓［6］。夏枯草有抑制去甲腎上腺素引起的家兔胸主動脈收縮的作用［7－8］，降低腎上腺素模擬病態(tài)下的家兔血壓［9］。丹參通過提高NO構(gòu)成酶的水平，擴張血管而降低血壓［10－11］。玉米須降低AngⅡ水平，并具有抗氧化應(yīng)激作用，對自發(fā)性高血壓大鼠有降壓作用［12］。大黃能抑制去氧腎上腺素和組胺誘導(dǎo)的縮血管反應(yīng)［13］。以上研究提示，6種中藥均具有一定的降壓作用，在臨床上對高血壓1級患者也顯示了較好的治療效果。然而復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓的藥理學(xué)機制尚不明確，故本研究擬應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機制，為其后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 活性成分的獲取及篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù) 據(jù) 庫（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）進(jìn)行檢索，獲得鬼針草、茵陳、夏枯草、丹參、玉米須、大黃的化學(xué)成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug－likeness，DL）≥0.18為條件［14］，篩選出復(fù)方鬼針草顆粒的有效活性成分。

1.2 藥物靶點及疾病靶點的獲取利用PubChem數(shù)據(jù)庫（http：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）獲取活性成分的Smiles結(jié)構(gòu)，利用活性成分的Smiles結(jié)構(gòu)在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中（http：／／www.swisstargetprediction.cn／）對藥物作用靶點進(jìn)行預(yù)測，并以Probability≥50%為條件進(jìn)行靶點篩選。將在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫與TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得的藥物靶點進(jìn)行整合得到所有的藥物作用靶點。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：／／www.uniprot.org／）對靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：／／www.genecards.org／）與OMIM數(shù)據(jù)庫（http：／／www.omim.org／）中以“hypertension”為關(guān)鍵詞對疾病靶點進(jìn)行預(yù)測，由于高血壓靶點過多，設(shè)置Relevance score≥5%為條件對靶點進(jìn)行篩選。

1.3 共同靶點篩選及蛋白相互作用（protein－protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將藥物作用靶點與疾病靶點導(dǎo)入Veney2.1軟件（http：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）中取交集，獲取藥物－疾病共同靶點，并繪制韋恩圖。在STRING數(shù)據(jù)庫（https：／／string－db.org／）中檢索藥物－疾病共同靶蛋白，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，設(shè)置相互作用閾值≥0.400，并隱藏游離點，得出共同作用靶點之間的互作關(guān)系，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化。

1.4 “中藥－活性成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物－疾病的共同靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建出“中藥－活性成分－靶點－疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）分析和KEGG通路富集分析將上述共同作用靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù) 庫（https：／／david.ncifcrf.gov／）進(jìn) 行GO和KEGG通路注釋，以P值＜0.05為條件篩選出相應(yīng)的通路。在Omishare Tool（https：／／www.omicshare.com／tools／Home／Soft／seniorbubble）的高級氣泡圖中將其結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的獲取及篩選結(jié)果利用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集復(fù)方鬼針草顆粒中各味中藥所含的化合物成分，然后根據(jù)OB、DL值篩選后得到鬼針草、茵陳、夏枯草、丹參、玉米須、大黃所含活性成分依次為6、13、11、65、12、16個，去除8個重復(fù)活性成分及21個未找到對應(yīng)靶點的活性成分，共獲得有效活性成分94個。其中木犀草素（luteolin）為鬼針草、夏枯草、丹參、玉米須4種藥物的共同活性成分，槲皮素（quercetin）為鬼針草、茵陳、夏枯草3種藥物的共同活性成分，β－谷甾醇（beta－sitosterol）為茵陳、夏枯草、大黃3種藥物的共同活性成分，豆甾醇（stigmasterol）為夏枯草、玉米須兩種藥物的共同活性成分。見圖1。

2.2 疾病靶點的收集、藥物作用靶點的預(yù)測及網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將94個復(fù)方鬼針草顆?；钚猿煞謱?dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，將所得靶點與TCMSP數(shù)據(jù)庫中所得靶點合并獲得復(fù)方鬼針草顆粒所有靶點。檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出與高血壓相關(guān)疾病靶點。將復(fù)方鬼針草顆粒所有靶點與疾病靶點導(dǎo)入Veney2.1軟件，最終獲得藥物－疾病共同作用靶點146個，并繪制韋恩圖。見圖2。

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析將146個共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，得到蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，然后通過Cytoscape3.7.2軟件進(jìn)行可視化，見圖3。由圖可知復(fù)方鬼針草顆粒共同靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中有145個節(jié)點，20 880條邊，平均節(jié)點度值（Degree）為38.152。顏色越深、節(jié)點越大的圓形靶標(biāo)節(jié)點表示Degree越高，說明其在復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。

圖1 復(fù)方鬼針草顆粒所含活性成分的Upset圖

圖2 復(fù)方鬼針草顆粒－高血壓靶點韋恩圖

圖3 復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓靶點蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 “中藥－活性成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2軟件將6種藥物、94個藥物活性成分與146個疾病靶點相連，繪制出“中藥－活性成分－靶點－疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。其中藥物與疾病用圓形表示，活性成分用三角形表示，靶點用箭頭表示，此網(wǎng)絡(luò)共包括247個節(jié)點、1 580條邊。結(jié)果顯示，槲皮素（度值104）、山柰酚（度值48）、木犀草素（度值45）等活性成分度值較高。核心靶點涉及血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、RAC－α絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（RAC－alpha serine／threonine－protein kinase，AKT1）、白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。

圖4 復(fù)方鬼針草顆粒的“中藥－成分－靶點－疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集分析對146個共同靶點進(jìn)行GO富集分析，GO富集分析包括生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）及細(xì)胞組分（cellular component）3個分支。設(shè)定閾值P＜0.05，共富集854個條目。結(jié)果顯示，復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓的生物過程涉及藥物反應(yīng)、缺氧應(yīng)答、衰老、血管收縮正調(diào)控、細(xì)胞對脂多糖的應(yīng)答、細(xì)胞增殖正調(diào)控、基因表達(dá)正調(diào)控、凋亡過程負(fù)調(diào)控、對雌二醇應(yīng)答等，與酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、血紅素結(jié)合、類固醇激素受體活性、細(xì)胞活性因子、蛋白同源二聚化活性、腎上腺素結(jié)合、類固醇結(jié)合、蛋白異源二聚化活性等分子功能相關(guān)，涉及細(xì)胞外間隙、漿膜、陷窩、膜筏、質(zhì)膜整體成分、細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞表面、質(zhì)膜外側(cè)、受體復(fù)合物、頂端質(zhì)膜等細(xì)胞組分。篩選每個組分靠前的前10個條目，繪制圖表，見圖5。

2.6 KEGG通路富集分析KEGG通路富集，設(shè)定閾值P＜0.05，共富集到122條通路，選擇密切相關(guān)的前20條信號通路，通過Omicshare軟件制作高級氣泡圖，見圖6。復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓主要涉及蛋白多糖、TNF信號通路、乙型肝炎、膀胱癌、南美錐蟲?。乐掊F蟲?。?、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor－1，HIF－1）信號通路、瘧疾、利什曼病、胰腺癌、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子（forkhead transcription factor，F(xiàn)oxO）信號通路、黏著斑、弓形蟲病、環(huán)磷酸鳥苷（3′－5′－cyclic guanosine monophosphate，cGMP）－蛋白激酶G（dependent protein kinase G，PKG）信號通路、磷酸肌醇3激酶（phosphoinositol 3 kinase，PI3K）－蘇氨酸蛋白激酶（threonine－protein kinases，AKT）信號通路、催乳激素信號通路、類風(fēng)濕性節(jié)炎、Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）信號通路、百日咳、結(jié)直腸癌等。

圖5 復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓潛在靶點的GO富集分析條形圖

3 討論

高血壓的發(fā)病主要與腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)激活、血管內(nèi)皮功能受損、交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)等有關(guān)［15－17］。此外，血管收縮、細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控等生物過程，已被證實在高血壓的發(fā)病過程中起著重要作用［18－19］。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果顯示：復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚和木犀草素等94個，核心靶點涉及VEGFA、AKT1、IL－6、TNF等146個?，F(xiàn)代藥理研究顯示，槲皮素具有降低血壓、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等作用［20－22］，可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群，減少脂多糖的產(chǎn)生，下調(diào)TLR4／核因子κB（nuclear factor－κB，NF－κB）p65的表達(dá)，進(jìn)而降低血壓［23］；山柰酚可能通過抗炎、對蛋白激酶抑制、免疫抑制、抗動脈粥樣硬化及降糖等作用調(diào)節(jié)血壓［24］；木犀草素通過抑制氧化應(yīng)激和NF－κB的激活而降低血壓［25］。有關(guān)核心靶點參與高血壓病理過程的相關(guān)文獻(xiàn)研究顯示，VEGFA能夠促進(jìn)血管生成，維持血管內(nèi)皮功能完整［26－27］，與血壓升高呈正相關(guān)。AKT1在細(xì)胞增殖、遷移、調(diào)控凋亡等方面發(fā)揮重要作用，抑制AKT后可加強由NO引起的血管舒張而發(fā)揮降壓作用［28］，并能在活化后促進(jìn)AngeⅡ誘導(dǎo)的高血壓心肌纖維化［29］。TNF引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致血管重塑［30］，還能促進(jìn)IL－6的表達(dá)，參與血管平滑肌細(xì)胞的增殖、分化和調(diào)控，使管壁增厚、管腔狹窄、外周血管阻力增高，最終導(dǎo)致高血壓發(fā)生［31］。IL－6與原發(fā)性高血壓具有獨特相關(guān)性，它可引起血管收縮、與血管緊張素Ⅱ相互作用等多種途徑引起血壓升高［32］。從以上結(jié)果可以看出，這些核心靶點與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)，這也是對GO富集分析結(jié)果中核心靶點調(diào)控血管收縮、細(xì)胞增殖、凋亡等生物過程的佐證。

KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示，復(fù)方鬼針草顆粒治療高血壓涉及的通路主要包括TNF信號通路、HIF－1信號通路、cGMP－PKG信號通路、PI3K－Akt信號通路、TLRs信號通路等。研究顯示，HIF－1、cGMP－PKG、PI3K－Akt等信號通路與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)，參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展。HIF－1信號通過對NO的調(diào)節(jié)影響血管舒張，進(jìn)而調(diào)控血壓水平［33］。cGMP－PKG信號通路可由NO激活，導(dǎo)致血管平滑肌松弛，擴張血管，降低外周血管阻力，從而降低血壓［34］。PI3K／Akt信號通路通過磷酸化L－型鈣通道上的Cavβ2α亞基激活L－型鈣通道引起Ca2＋內(nèi)流，從而導(dǎo)致血管收縮［35］，因此，抑制PI3K／Akt信號通路可以降低血壓。TNF、TLRs等信號通路與炎癥相關(guān)，介導(dǎo)了高血壓的發(fā)病。TNF信號通路被激活產(chǎn)生炎性復(fù)合物，通過激活NF－κB抑制酶以及絲裂原活化蛋白激酶，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)高血壓的發(fā)生發(fā)展［36］。TLRs中的TLR4與配體結(jié)合后，激活下游的NF－κB信號通路，產(chǎn)生促炎因子［37］，是導(dǎo)致高血壓發(fā)病的機制之一。這些研究結(jié)果也進(jìn)一步支持了本研究結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。

綜上所述，本研究所預(yù)測的復(fù)方鬼針草顆粒的活性成分所作用的作用靶點，不同程度地參與了上述生物學(xué)過程和信號通路而發(fā)揮降低血壓作用，為后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行該藥治療高血壓的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供了參考依據(jù)。