楊 榕，李慶祥，王逸飛，周 聞，王 雯，郭傳瑸，劉 浩△，郭玉興△

(1.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院，口腔頜面外科 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；3.河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，石家莊 050017)

顱底-顳下區(qū)腫瘤位置深在，毗鄰溝通顱內(nèi)外的頸內(nèi)動(dòng)、靜脈和Ⅸ～Ⅻ顱神經(jīng)[1]，在臨床操作時(shí)入路困難[2-3]。采用CT影像技術(shù)，尤其是增強(qiáng)CT技術(shù)經(jīng)導(dǎo)航設(shè)計(jì)軟件行三維重建可以充分顯示腫瘤范圍和頸內(nèi)動(dòng)脈、頸內(nèi)靜脈及顱頜面骨性結(jié)構(gòu)，據(jù)此可設(shè)計(jì)穿刺活檢或腫瘤切除手術(shù)方案[4-5]，但手術(shù)過程中常無(wú)法對(duì)顱底惡性腫瘤進(jìn)行充分的擴(kuò)大切除，手術(shù)后常需輔以放療或化療，常見腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。

為了更好地研究顱底-顳下區(qū)惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)特點(diǎn)，我們嘗試建立了顱底-顳下區(qū)惡性腫瘤小鼠模型。在利用Micro-CT分析動(dòng)物模型時(shí)，雖然其可精確顯影礦化組織[7]，但由于軟組織對(duì)X線的衰減作用小，無(wú)法形成良好的軟組織對(duì)比度，因此無(wú)法對(duì)腫瘤及周圍軟組織實(shí)現(xiàn)有效評(píng)估。既往研究多采用對(duì)比增強(qiáng)劑(碘制劑及四氧化鋨等)浸染以提高軟組織分辨率[8]。本研究中我們嘗試?yán)媒M織滲透性強(qiáng)、毒性低、易于獲取的復(fù)方碘液進(jìn)行顱底腫瘤小鼠標(biāo)本浸染，顯著提升了軟組織觀察效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

12只BALB/c裸鼠4～5周齡，體質(zhì)量14～16 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0011。達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，0.1 U/L青霉素和100 g/L鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))復(fù)方碘液購(gòu)自山東臨沂永安化驗(yàn)室，蘇木精-伊紅染液、兔抗人廣譜細(xì)胞角蛋白多克隆抗體(26411-1-AP)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，PV-9001兔二步法檢測(cè)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。小動(dòng)物超聲系統(tǒng)(VisualSonics Vevo?1100)購(gòu)自加拿大，Micro-CT(西門子Inveon MM Gantry-STD)購(gòu)自德國(guó)，影像數(shù)據(jù)分析軟件(iPlan 3.0 BrainLAB)購(gòu)自德國(guó)。

1.2 動(dòng)物模型建立

試驗(yàn)方案獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(批準(zhǔn)號(hào)：LA2018247)。試驗(yàn)開始前1周，將小鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)于北京大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系WSU-HN6來(lái)自北京大學(xué)口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳。

采用吸入式簡(jiǎn)易麻醉儀以異氟烷對(duì)小鼠鎮(zhèn)靜麻醉后，將其固定于操作臺(tái)，采用小動(dòng)物超聲行頜下區(qū)掃描，判斷頸部主要血管位置。然后用1 mL胰島素注射器，將20 μL含有2×106個(gè)的WSU-HN6細(xì)胞經(jīng)右側(cè)頜下區(qū)注射至右側(cè)顳下窩區(qū)域。注射細(xì)胞時(shí)，左手固定小鼠頭部及背部，右手持注射器貼小鼠右側(cè)下頜骨下緣進(jìn)針。進(jìn)針深度約4 mm，緩慢注射細(xì)胞，完成注射后停頓30 s，快速撤出注射器避免針道腫瘤種植。細(xì)胞注射后每隔1 d觀察小鼠活動(dòng)狀態(tài)，至第3周，小鼠經(jīng)過量二氧化碳安樂死后脫頸處理。解剖小鼠頭顱標(biāo)本，以4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液固定24 h以上。

1.3 3.75%復(fù)方碘液浸染

將100 mL 5%復(fù)方碘液中加入300 mL蒸餾水，濃度稀釋至3.75%[9]。碘單質(zhì)(I2)在水中的溶解度極小，但在碘化鉀(KI)溶液中可以與解離的碘離子(I-)結(jié)合形成穩(wěn)定的I3-，即為復(fù)方碘液中的活性物質(zhì)[10]。將固定后的小鼠頭顱標(biāo)本使用3.75%復(fù)方碘液持續(xù)浸染4 d。

1.4 Micro-CT影像掃描及數(shù)據(jù)分析

小鼠頭顱標(biāo)本固定后先行非碘液處理掃描，再經(jīng)3.75%復(fù)方碘液浸染4 d后使用磷酸鹽緩沖液充分沖洗標(biāo)本，重新行Micro-CT掃描[11]。兩次掃描條件一致，均為9 μm、60 kV、220 μA，掃描數(shù)據(jù)以DICOM格式存儲(chǔ)。以上兩組掃描的DICOM影像數(shù)據(jù)導(dǎo)入影像數(shù)據(jù)分析軟件，比較分析顱底腫瘤位置和顱骨完整性。

1.5 組織學(xué)評(píng)價(jià)

小鼠頭顱標(biāo)本去皮后，采用20% (體積分?jǐn)?shù))乙二胺四乙酸脫鈣2～4周，經(jīng)系列濃度乙醇脫水，石蠟包埋后行組織連續(xù)切片，層厚5～6 μm，以標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。采用非生物素即用型二步法免疫組織化學(xué)方法染色，檢測(cè)廣譜細(xì)胞角蛋白的表達(dá)。病理學(xué)切片采用光學(xué)顯微鏡及體視顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物建模情況

在對(duì)12只小鼠進(jìn)行細(xì)胞注射的過程中2只出現(xiàn)頸部血腫立即死亡，其余小鼠采用小動(dòng)物超聲定期檢查，術(shù)后3周可見到兩側(cè)頜下區(qū)出現(xiàn)明顯不對(duì)稱，由此初步判斷腫瘤已經(jīng)形成。采用過量二氧化碳進(jìn)行安樂死處理后，以4%多聚甲醛固定頭部標(biāo)本，進(jìn)行后續(xù)檢查、分析。

2.2 Micro-CT掃描結(jié)果

用Micro-CT掃描非碘液處理的標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)小鼠顱骨整體不對(duì)稱，下頜升支內(nèi)側(cè)可見部分壓迫吸收，顳骨鱗部骨破壞明顯，但無(wú)法辨別軟組織影像(圖1A、B)。經(jīng)3.75%復(fù)方碘液浸染4 d后，在Micro-CT中可以清晰分辨軟組織影像。經(jīng)過辨認(rèn)咀嚼肌的分布走行輪廓，并與腫瘤細(xì)胞注射側(cè)進(jìn)行比較分析，可見顱底腫物的主體位于下頜升支內(nèi)側(cè)、顳骨鱗部下、外側(cè)，腫物經(jīng)顴弓向側(cè)面部突出(圖1C、D)。

A,B,coronal and axial views of Micro-CT scan before compound iodine solution staining indicated the bony invasion on the right side of the skull base easily (white arrows),but couldn’t determine the tumor location precisely;C,D,coronal and axial views of Micro-CT scan after compound iodine solution staining,reflected the skull base tumor (red dotted lines) from the surrounded muscles easily.圖1 采用3.75%復(fù)方碘液浸染前后小鼠Micro-CT影像學(xué)表現(xiàn)Figure 1 Micro-CT images of nude mice before and after staining with compound iodine solution

2.3 蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學(xué)染色分析

蘇木精-伊紅染色觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤與周圍軟組織結(jié)構(gòu)界限清晰。免疫組織化學(xué)染色顯示腫瘤為上皮來(lái)源的鱗狀細(xì)胞癌，同時(shí)在顱骨破壞的區(qū)域可以看見多核的破骨細(xì)胞(圖2)。

A,H-E staining showed a mass of atypia epithelial cells from the skull base tumor specimen;B,human cytokeratin immunohistochemical staining showed that the tumor was epithelial-derived squamous cell carcinoma;C,H-E staining of the destruction region of skull bone,red box shows the bone tissue with empty bone lacuna,black dotted box was enlarged as the figure 2D;D,the polynuclear osteoclasts at the margin of skull base bone resorption indicated by red arrow.圖2 蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色觀察顱底腫瘤特點(diǎn)Figure 2 Skull base tumors of murine model verified using H-E and immunohistochemical staining

3 討論

我們的既往研究提示腫瘤與顱底位置關(guān)系、腫瘤惡性程度及腫瘤大小都是影響腫瘤預(yù)后的重要因素，而腫瘤局部復(fù)發(fā)是治療失敗最常見的原因[6]。為了更好地進(jìn)行顱底-顳下區(qū)腫瘤的診斷及治療研究，需要建立顱底-顳下區(qū)腫瘤動(dòng)物模型。查閱文獻(xiàn)后我們發(fā)現(xiàn)目前國(guó)內(nèi)外并沒有顱底-顳下區(qū)腫瘤動(dòng)物模型，為此我們嘗試建立了小鼠顱底-顳下區(qū)腫瘤動(dòng)物模型。

在實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)過程中，我們發(fā)現(xiàn)Micro-CT掃描雖可清晰顯示顱骨形態(tài)及骨破壞的部位及程度，但腫瘤及周圍軟組織密度均一，無(wú)法辨別腫瘤的位置、邊界等結(jié)構(gòu)特征。文獻(xiàn)報(bào)道碘制劑浸染是個(gè)理想的選擇，2009年Metscher[11]利用10%復(fù)方碘液對(duì)胚胎標(biāo)本浸染后行Micro-CT掃描，取得了良好的軟組織分辨率，之后Jeffery等[10]及Wu等[12-13]學(xué)者研究顯示，將人體或動(dòng)物標(biāo)本浸染于3.75%復(fù)方碘液7 d后再行Micro-CT掃描即可取得穩(wěn)定、清晰的肌纖維及脂肪等軟組織影像，其原理主要在于碘(I)元素具有較高的原子序數(shù)(53)及原子量(126.9)，可引起很強(qiáng)的X線衰減和電子背散射作用。軟組織浸染后，由于I3-與不同組織親和力不盡相同，導(dǎo)致碘元素分布差異，不同軟組織間的密度差異增大，從而使X線影像出現(xiàn)明顯差異[14]，彌補(bǔ)了軟組織在Micro-CT影像中的低對(duì)比度缺陷。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3.75%復(fù)方碘液浸染小鼠頭顱標(biāo)本4 d后再行Micro-CT掃描即可清晰辨認(rèn)腫瘤、軟組織(主要為肌纖維和脂肪組織)及顱骨結(jié)構(gòu)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證動(dòng)物模型的腫瘤形成情況，我們隨之進(jìn)行組織學(xué)觀察。蘇木精-伊紅染色可以證實(shí)顱底區(qū)確有腫瘤形成，且腫瘤靠近中心部位有壞死灶發(fā)生。同時(shí)我們還觀察到顱骨破壞區(qū)存在多核破骨細(xì)胞，為了明確所形成腫瘤與我們植入的腫瘤細(xì)胞是否來(lái)源一致，我們進(jìn)行了人角蛋白的免疫組織化學(xué)染色。兔抗人廣譜細(xì)胞角蛋白抗體可標(biāo)記人上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤，其結(jié)果證實(shí)小鼠右側(cè)顱底區(qū)的組織團(tuán)塊確為人源性上皮來(lái)源的鱗狀細(xì)胞癌。

以上證據(jù)表明經(jīng)過我們的方法可以成功建立顱底-顳下區(qū)腫瘤動(dòng)物模型。復(fù)方碘液浸染在Micro-CT觀察中有很重要的作用，它是一種組織滲透性強(qiáng)、毒性低、操作簡(jiǎn)便且易于獲得的對(duì)比增強(qiáng)劑，可以幫助清晰分析腫瘤、相鄰顱骨及周圍軟組織形態(tài)，在腫瘤的骨侵犯研究中有著明顯優(yōu)勢(shì)。對(duì)于顱底-顳下區(qū)腫瘤的特點(diǎn)還可以采用Micro-MRI進(jìn)行檢測(cè)分析，但其無(wú)法顯示清晰顯示顱骨骨質(zhì)特征，并且價(jià)格昂貴，所以普及率低，因此，我們建立的這種顱底-顳下區(qū)惡性腫瘤動(dòng)物模型可以模擬臨床情況，根據(jù)腫瘤特點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的放射治療、化學(xué)治療，采用3.75%復(fù)方碘液浸染后再行Micro-CT掃描可以很好地進(jìn)行治療效果評(píng)價(jià)。