陳占功，趙小偉，吳劍坤，夏雪竹，毛克臣

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100010)

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑益腎堅骨丸是由熟地黃、菟絲子及山藥等12味中藥制成的水蜜丸，臨床應(yīng)用多年，功能為補腎填精、強壯筋骨，用于肝腎陰虛引起的骨質(zhì)疏松及骨關(guān)節(jié)痛、腰酸腿軟、潮熱盜汗以及神疲乏力等。原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了丹參酮ⅡA的薄層色譜鑒別。為提高該制劑的質(zhì)量控制水平，本研究建立了質(zhì)量控制方法，以期全面、有效地控制該藥質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent-1260型高效液相色譜儀(Agilent公司)，PB203-N型電子天平(METTLER TOLEDO公司)。OLYMPUSC-X43型顯微鏡(OLYMPUS公司)。

1.2 藥品與試劑

益腎堅骨丸(批號：1912092、1912093和2002012，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供)；處方飲片(北京杏林藥業(yè)有限責(zé)任公司)；山茱萸對照藥材(批號：120923-200911)、丹參對照藥材(批號：120923-201615)、蒼術(shù)對照藥材(批號：120983-201605)、莫諾苷對照品(批號：111998-201602)、馬錢苷對照品(批號：111640-201606)均來源于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G(青島海洋化工廠分廠)；羧甲基纖維素鈉(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)；薄層板[自制：硅膠G-0.5%CMC-Na(質(zhì)量比為3∶1)，機鋪后自然干燥，105 ℃干燥30 min，至干燥器中備用]；所用試劑均為分析純(北京化學(xué)試劑公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取3批益腎堅骨丸適量，分別粉碎成細(xì)粉，置于10×40倍顯微鏡下觀察[1]。

2.1.1 熟地黃顯微特征：薄壁組織灰棕色至黑棕色，細(xì)胞多皺縮，內(nèi)含棕色核狀物。經(jīng)3批樣品觀察，均可檢出，見圖1。

A.批號：1912092；B.批號：1912093；C.批號：2002012A.batch number：1912092)；B.batch number：1912093)；C.batch number：2002012)圖1 益腎堅骨丸中熟地黃黃的顯微鑒別圖(薄壁組織)Fig 1 Microscopic identification diagram of Radix rehmanniae in Yishen Jiangu pills(parenchymatous tissue)

2.1.2 菟絲子顯微特征：種皮表皮細(xì)胞和種皮珊狀細(xì)胞，具光輝帶，方中鑒定其種皮珊狀細(xì)胞。經(jīng)3批樣品觀察，均可檢出，見圖2。

A.批號：1912092；B.批號：1912093；C.批號：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012圖2 益腎堅骨丸中菟絲子的顯微鑒別圖(種皮珊狀細(xì)胞)Fig 2 Microscopic identification diagram of Semen cuscutae in Yishen Jiangu pills (testa cells)

2.1.3 茯苓顯微特征：不規(guī)則顆粒狀團塊和分枝狀團塊無色，遇水合氯醛試液溶化；菌絲無色或淡棕色，細(xì)長，稍彎曲，有分枝，直徑3～8 μm。為便于在復(fù)方制劑中尋找，本研究選用加水合氯醛，不加熱透化觀察。經(jīng)3批樣品觀察，均可檢出，見圖3。

A.批號：1912092；B.批號：1912093；C.批號：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012圖3 益腎堅骨丸中茯苓的顯微鑒別圖(不規(guī)則顆粒狀團塊和分枝狀團塊)Fig 3 Microscopic identification diagram of Poria in Yishen Jiangu pills(irregular granular agglomerates and branched agglomerates)

2.1.4 山藥顯微特征：淀粉粒單粒扁圓形、三角狀卵形、類圓形或矩圓形，直徑8～35 μm，臍點點狀、人字狀、十字狀或短縫狀，可見層紋；草酸鈣針晶存在于黏液細(xì)胞中。本研究將淀粉粒和草酸鈣針晶一起用于鑒別山藥，經(jīng)3批樣品觀察，均可檢出3批樣品，見圖4—5。

A.批號：1912092；B.批號：1912093；C.批號：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012圖4 益腎堅骨丸中山藥的顯微鑒別圖(淀粉粒)Fig 4 Microscopic identification diagram of Rhizoma dioscoreae in Yishen Jiangu pills(starch granule)

A.批號：1912092；B.批號：1912093；F.批號：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012圖5 益腎堅骨丸中山藥的顯微鑒別圖(草酸鈣針晶)Fig 5 Microscopic identification diagram of Rhizoma dioscoreae in Yishen Jiangu pills(calcium oxalate needle crystal)

2.1.5 澤瀉顯微特征：薄壁細(xì)胞類圓形，具多數(shù)橢圓形紋孔，集成紋孔群。經(jīng)3批樣品觀察，均可檢出，見圖6。

A.批號：1912092；B.批號：1912093；C.批號：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012圖6 益腎堅骨丸中澤瀉的顯微鑒別圖(薄壁細(xì)胞)Fig 6 Microscopic identification diagram of Rhizoma alismatis in Yishen Jiangu pills(parenchymatous tissue)

2.2 薄層色譜鑒別

取益腎堅骨丸12 g，粉碎成細(xì)粉，以乙醚為溶劑進(jìn)行超聲提取，共2次，每次25 ml，15 min，濾過，合并提取液，揮盡溶劑，剩余殘渣加乙酸乙酯1 ml溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材0.5 g、山茱萸對照藥材0.5 g、蒼術(shù)對照藥材0.5 g，以相同方法制成各對照藥材溶液。另按益腎堅骨丸處方中藥味比例，分別取不含山茱萸、丹參和蒼術(shù)的其他中藥材飲片，并按益腎堅骨丸制備工藝制成空白制劑，再按供試品溶液制備方法制成丹參陰性對照液、山茱萸陰性對照液和蒼術(shù)陰性對照液。依照《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)通則0502收載的薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液10 μl、陰性對照液各10 μl及對照藥材溶液各3 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，采用石油醚(60～90 ℃)-丙酮(V∶V=9∶2)展開，取出，晾干，日光下檢視，薄層色譜圖見圖7。結(jié)果表明，在供試品色譜中，與丹參對照藥材色譜相應(yīng)位置處可見相同顏色的斑點，丹參陰性對照無干擾。繼續(xù)噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點清晰，日光下檢視，薄層色譜圖見圖8。結(jié)果表明，在供試品色譜中，與山茱萸、蒼術(shù)對照藥材色譜相應(yīng)位置處可見相同顏色的斑點，山茱萸陰性對照和蒼術(shù)陰性對照均無干擾。

1.丹參陰性對照；2.丹參對照藥材；3.供試液(批號：1912092)；4.供試液(批號：1912093)；5.供試液(批號：2002012)；6.蒼術(shù)對照藥材；7.蒼術(shù)陰性對照；8.山茱萸陰性對照；9.山茱萸對照藥材；10.供試液(批號：1912092)；11.供試液(批號：1912093)；12.供試液(批號：2002012)1.Salviae miltiorrhizae for negative control;2.Salviae miltiorrhizae for contrast medicinal material;3.test solution(batch number：1912092);4.test solution(batch number：1912093);5.test solution(batch number：2002012);6.Atractylodes macrocephala for contrast medicinal material;7.Atractylodes macrocephala for negative control;8.Cornus officinalis for contrast medicinal material;9.Cornus officinalis for negative control;10.test solution(batch number：1912092);11.test solution(batch number：1912093);12.test solution(batch number：2002012)圖7 丹參薄層色譜圖Fig 7 Thin layer chromatogram of salviae miltiorrhizae

2.3 莫諾苷及馬錢苷的含量測定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性[1]：色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相以乙腈為A相、0.3%磷酸溶液為B相，梯度洗脫程序為0～20 min，7%A；20～50 min，7%～20%A。檢測波長為240 nm，理論板數(shù)按馬錢苷峰計算應(yīng)≥10 000。

2.3.2 對照品溶液的制備：精密稱取一定量的莫諾苷、馬錢苷對照品，加80%甲醇制成每1 ml含莫諾苷46 μg、馬錢苷49 μg的混合溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備：取益腎堅骨丸，粉碎成細(xì)粉，精密稱定6 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，冷卻后再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液作為供試品溶液。

2.3.4 陰性對照溶液的制備：按益腎堅骨丸處方，取不含山茱萸的其他中藥材飲片，按益腎堅骨丸制法及供試品溶液制備方法制成山茱萸陰性對照溶液。

2.3.5 專屬性試驗：分別精密吸取莫諾苷、馬錢苷對照品混合溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，在“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖，結(jié)果見圖9?？梢姡谠撋V條件下陰性對照無干擾，專屬性強。

2.3.6 線性關(guān)系的考察：精密吸取莫諾苷(46 μg/ml)、馬錢苷對照品溶液(49 μg/ml)分別進(jìn)樣8、10、12、14、16及18 μl，根據(jù)“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，測定各峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，求得莫諾苷回歸方程Y=1 468X-170.4(r2=0.999 9)，馬錢苷回歸方程Y=1 702X-11.86，(r2=0.999 9)，表明莫諾苷在0.368～0.0.828 μg范圍內(nèi)、馬錢苷在0.392～0.882 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液各10 μl，于0、2、4、6及8 h分別進(jìn)樣，測定峰面積，測得莫諾苷峰面積RSD為0.56%，馬錢苷峰面積RSD為0.63%。結(jié)果表明，樣品供試液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 精密度試驗：精密吸取莫諾苷、馬錢苷對照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計算得莫諾苷RSD為0.16%，馬錢苷RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗：取同一批號益腎堅骨丸樣品6份，按“2.3.3”項下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣量10 μl，測定峰面積值并計算含量，結(jié)果顯示，莫諾苷RSD為0.59%，馬錢苷RSD為2.36%，表明重復(fù)性良好。

2.3.10 回收率試驗：精密稱定已知含量的益腎堅骨丸樣品6份，加入一定量的混合對照品溶液，其余操作步驟同“2.3.3”項下供試品溶液制備方法，采用“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1—2。

表1 莫諾苷加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Results of modified sample recovery test of morroniside

2.3.11 樣品含量測定：取3個批號的益腎堅骨丸樣品各約6 g，精密稱定，采用“2.3.3”項下供試品溶液制備方法制得供試品溶液，采用“2.3.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量10 μl，記錄莫諾苷、馬錢苷的峰面積，并計算其含量，結(jié)果見表3。

A.供試品；B.對照品；C.陰性對照品A.test substance;B.control substance;C.negative control substance圖9 莫諾苷及馬錢苷含量測定的HPLC圖譜Fig 9 HPLC of the content determination of morroniside and strychnine

表2 馬錢苷加樣回收率試驗結(jié)果Tab 2 Result of modified sample recovery test of strychnine

表3 樣品的含量測定結(jié)果(mg/g)Tab 3 Result of content measurement of sample(mg/g)

3 討論

本研究使用同一種展開劑同時鑒別3種藥材，具有簡便、經(jīng)濟和環(huán)保的特點，效果較佳。

本研究還對蒼術(shù)、牡丹皮及黃精進(jìn)行了薄層色譜鑒別試驗研究。本制劑中蒼術(shù)的量非常少，在取樣品量達(dá)到12 g時，才可以顯出1個對應(yīng)的斑點。曾進(jìn)行展開劑的篩選：(1)石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯(V∶V=10∶0.5)[2]；(2)石油醚(60～90 ℃)-丙酮(V∶V=9∶2)[1]。由于展開劑(2)可以使丹參、山茱萸同時得到鑒別，而且分離效果較佳，故選用展開劑(2)。牡丹皮薄層層析鑒別，對展開系統(tǒng)進(jìn)行了篩選[3-4]，結(jié)果顯示，空白中均有干擾，因此未列入正文。

山茱萸具有補益肝腎、收澀固脫的功效[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，山茱萸在治療炎癥、保護心腦血管和抗氧化等方面的功效突出[6]。其主要成分有環(huán)稀醚萜、三萜及鞣質(zhì)等，主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類[7]，其中馬錢苷、莫諾苷含量最高[8]，而現(xiàn)有研究也主要聚焦于山茱萸的主要組分的含量測定[9-11]。本研究將莫諾苷和馬錢苷作為益腎堅骨丸中的主要含量測定指標(biāo)。

益腎堅骨丸作為院內(nèi)制劑在臨床上使用多年，對于骨質(zhì)疏松有很好的療效。近年來，隨著人口老齡化進(jìn)程加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年升高，目前已成為嚴(yán)重危害國民身體健康的公共健康問題[12]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率已穩(wěn)居世界多發(fā)病、常見病發(fā)病率的第7位,老年人骨質(zhì)疏松癥的高發(fā)病率已經(jīng)僅略次于心腦血管病,成為全球性的重要健康問題[13]。劉明慧等[14]的研究結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松癥的病因較為復(fù)雜，應(yīng)予以辨證施治。李穎等[15]認(rèn)為，骨質(zhì)疏松癥的病機特點可主要概括為多瘀、多虛。近年來，隨著中醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展與實踐，于骨質(zhì)疏松癥治療方面獲取了顯著的成效[16]。

特色制劑來源于驗方、協(xié)定處方，這些特色制劑臨床使用方便，又體現(xiàn)了學(xué)科發(fā)展的水平[17]。特別是在綜合醫(yī)院，特色產(chǎn)品和特色服務(wù)是重中之重，而院內(nèi)制劑可以滿足要求，可作為“差異化服務(wù)”，成為醫(yī)院的特色產(chǎn)品，提供個性化和人性化的服務(wù)，且院內(nèi)制劑具有市場中無可替代品、治療作用明確、?？铺厣珡娗叶靖弊饔玫偷忍攸c[18-19]。

益腎堅骨丸在臨床上應(yīng)用多年，但一直以來缺乏科學(xué)而全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立了該藥的定性與定量的質(zhì)量控制方法，以促進(jìn)中藥制劑的傳承與發(fā)展。