王 涵， 高盼盼， 李 天， 許璐璐， 張辰露

(陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000)

附子為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliiDebx.)子根的加工品，是典型的毒性中藥，具有回陽救逆、散寒止痛的功效[1]。臨床使用前必須經(jīng)過特定工藝炮制，將毒性較強的雙酯型生物堿DDAs水解生成毒性較低的單酯型生物堿MDAs[2]，目前臨床使用的附子飲片多以黑順片為主。漢中是國內(nèi)附子的主產(chǎn)區(qū)之一，其種植歷史已有300余年，且種植規(guī)模居全國前列，但附子炮制加工依然存在諸多問題[3]，例如隨意變更蒸煮時間使附子飲片加工不足或過度，導致藥效成分含量過高或過低；重膽浸泡，導致飲片灰分超標等，嚴重影響了漢中附子飲片的整體品質(zhì)[4]。歷版《中華人民共和國藥典》收錄了黑順片炮制過程為“取泥附子按大小洗凈浸入膽巴的水溶液數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，切片，水漂，蒸至油面，烘干”。2020年版《中華人民共和國藥典》[1]中雖然增加了灰分檢測指標，但對浸膽時間、蒸煮時間、漂水時間等具體工藝步驟仍未明確操作規(guī)范[5]。因此，本文采用正交試驗與隸屬度法評價對黑順片炮制工藝進行優(yōu)化，為附子飲片產(chǎn)地加工實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

附子藥材由陜西華克生物醫(yī)藥有限公司提供，經(jīng)陜西理工大學生物科學與工程學院周天華博士鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭的子根。將新鮮的泥附子去掉須根，清洗干凈，從中取1份趁鮮切0.5 cm片，干燥制成生附片，作為對照組。

1.1.2 主要試劑

苯甲酰新烏頭原堿BMA(批號：19032406，純度≥99.73%)，苯甲酰烏頭原堿BAC(批號：18110710，純度≥98.99%)，苯甲酰次烏頭原堿BHA(批號：19032807，純度≥99.66%)，新烏頭堿MA(批號：18111001，純度≥98.12%)，烏頭堿AC(批號：18110905，純度≥98.01%)，次烏頭堿HA(批號：18111308，純度≥99.04%)，以上對照品均購于北京儀化通標科技有限公司。超純水(儀器)，乙腈、甲醇、二乙胺為HPLC級，鹽酸、氨水為分析級，膽巴。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Thermo Fisber Ultimate 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，ME104E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，SHZ-95B循環(huán)水式多用真空泵(河南鞏義市英峪予華儀器廠)，德國IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限公司)，Q-300DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DHG-9145電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，UPH-11-20T超純水機(四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 黑順片的炮制

附子2019年7月購于陜西漢中南鄭區(qū)胡家營附子生產(chǎn)基地，在2015版《中華人民共和國藥典》[6]中黑順片加工基本流程基礎(chǔ)上進行工藝優(yōu)化。按照泥附子個頭大小，挑選出同一等級的新鮮泥附子作為試驗材料，去除殘莖及毛根，清洗，浸泡于3 mol/L膽巴液中數(shù)日，之后按照煮制、切片、漂片、蒸制、烘干的基本流程處理。

1.2.2 酯型生物堿的含量測定

1.2.2.1 供試樣品溶液的制備

精密稱取生附子及黑順片炮制品粉末(過三號篩)2.00 g，平行稱取3份，置具塞錐形瓶中，加氨試液(體積分數(shù)40%氨水)2 mL，精密加入乙醚50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，用乙醚補足揮發(fā)的重量，過濾。精密量取濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，加入體積分數(shù)0.05%鹽酸甲醇混合溶液3 mL溶解，待殘渣完全溶解后用0.22 μm濾膜過濾，取濾液，即為供試品溶液，備用[7]。

1.2.2.2 對照品溶液的制備

取BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA對照品，精密稱量，加入體積分數(shù)0.05%鹽酸-甲醇混合溶液制成混合對照品母液。其中BMA濃度為1.08 mg/mL、BAC濃度為1.06 mg/mL、BHA濃度為0.80 mg/mL、MA濃度為1.07 mg/mL、AC濃度為1.06 mg/mL、HA濃度為0.98 mg/mL。分別吸取0.5、0.2、0.2、0.5、0.2、0.5 mL定容至10 mL制成混合對照品溶液①，再精密吸取混合對照品溶液①1 mL，加體積分數(shù)0.05%鹽酸-甲醇溶液稀釋至10 mL，搖勻，即得混合對照品溶液②?；旌蠈φ掌啡芤孩俸突旌蠈φ掌啡芤孩诜謩e上樣檢測，設(shè)置梯度進樣量。

1.2.2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以體積分數(shù)3 ‰二乙胺為流動相B，進行梯度洗脫(0～30 min，體積分數(shù)25%～45% A；30～40 min，體積分數(shù)45%～55% A；40～50 min，體積分數(shù)55%～65%A；50～60 min，體積分數(shù)65%～75% A)；檢測波長240 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)應(yīng)不低于5000，分離度>1.5。

1.2.2.4 樣品測定

取已知濃度的混合對照品溶液、供試品溶液，按照1.2.2.3項下色譜分析條件測定生附子及黑順片炮制品中6種主要生物堿BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA的含量。采用標準曲線法計算樣品中這6種酯型生物堿含量。

1.2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取1.2.2.2項下的混合對照品溶液①各3、5、10、15、20 μL和混合對照品溶液②各2、3、5、10、15 μL，注入液相色譜儀中，測定峰面積。以6種生物堿對照品的峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程及其線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 6種酯型生物堿線性范圍及線性關(guān)系

1.2.4 附子炮制工藝正交試驗

在黑順片傳統(tǒng)炮制工藝(洗凈、浸膽、煮透、水漂、切片、蒸透、烘透)的基礎(chǔ)上，考察選取了4個關(guān)鍵工藝因素，設(shè)置3個水平，因素水平見表2。取相同大小等級的新鮮泥附子樣品9份，每份約1 kg，設(shè)置3次平行，按照L9(43)正交表進行炮制處理，進行黑順片炮制工藝優(yōu)化研究。

表2 黑順片炮制工藝正交試驗因素水平

1.2.5 總灰分、酸不溶性灰分的測定

準確稱取附子樣品約4.00 g，參照文獻[8]灰分測定法對試驗樣品的總灰分、酸不溶性灰分指標進行考察,每個樣品設(shè)置3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 附子中6種酯型生物堿對照品和樣品的HPLC圖

分別取生附子及黑順片樣品，按1.2.2.1項下分別處理，得到供試品溶液，并取1.2.2.2項下附子6種酯型生物堿對照品混合液，按照1.2.2.3項下色譜條件進行測定，結(jié)果如圖1所示。

(b)生附子

(c)黑順片1.BMA； 2.BAC； 3.BHA； 4.MA； 5.AC； 6.HA圖1 附子生物堿對照品和供試品的HPLC圖

2.2 正交試驗結(jié)果分析

作為毒性藥材，附子飲片的品質(zhì)評價具有復雜性和不確定性的特點。本研究采用多維模糊綜合評判方法(隸屬度法)對黑順片質(zhì)量進行綜合評價。隸屬度法是針對受多種因素影響的事物做出全面評價的一種十分有效的多因素決策方法[9]。對于欲達到最大值的指標(如MDAs總含量和外觀評分)，其指標隸屬度=(指標值-指標最小值)/(指標最大值-指標最小值)；對于限量指標(如DDAs總含量)，其指標隸屬度=(指標最大值-指標值)/(指標最大值-指標最小值)。指標最大值的隸屬度為1，而限量指標的隸屬度為0，所以0≤指標隸屬度≤1[10]。為保障黑順片的安全性和有效性，在提高單酯型生物堿總含量與降低雙酯型生物堿總含量的同時，還要避免過度加工導致雙酯型生物堿完全消失，同時飲片品質(zhì)評價也需考慮飲片外觀性狀指標[11]。因此本研究以飲片傳統(tǒng)外觀性狀、單酯型生物堿總含量及雙酯型生物堿總含量為評價指標，評分時以各指標的最大值作為參照，對同一指標的數(shù)據(jù)進行標準化處理。權(quán)重比例為單酯型生物堿總含量占50%，雙酯型生物堿總含量占35%，外觀評分占15%，綜合評分=單酯型生物堿總含量評分×50%+雙酯型生物堿總含量評分×35%+炮制品外觀評分×15%，滿分為1.00[12]。正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

黑順片外觀性狀評分評價方法參照林華等的方法[10]，滿分為10分?！包S褐色發(fā)亮”“質(zhì)地實、酥脆斷面光澤”“氣微，無麻舌感”(10分)；“黃褐色”“質(zhì)地實、較為酥脆斷面較有光澤”“氣微，微有麻舌感”(7分)；“皮部褐色、木質(zhì)部為黃白色”“質(zhì)較堅實、略呈粉性斷面略有光澤”“氣微，有麻舌感”(5分)；“黃白色”“質(zhì)硬、呈粉性斷面粗糙”“氣微，麻舌感強烈”(1分)。

由表3和表4結(jié)果可知，影響黑順片質(zhì)量的因素主次順序為A(浸膽時間)>D(蒸制時間)>C(漂片次數(shù))>B(煮制時間)；其中浸膽時間、蒸制時間對綜合評分的主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，24 h內(nèi)漂片次數(shù)和煮制時間的作用影響程度未達顯著。通過綜合分析確定黑順片炮制的最佳工藝為A1B1C3D2，即浸膽7 d、煮10 min、漂片(24 h內(nèi)換3次水)、蒸制2.5 h。

表3 黑順片炮制工藝的正交試驗結(jié)果 n=3

表4 黑順片炮制工藝方差分析結(jié)果

2.3 最佳工藝驗證

為進一步驗證試驗結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性，再取大小同等級的新鮮泥附子各3份，每份1000 g，按上述A1B1C3D2最佳工藝進行炮制，并對其炮制過程分步采樣，檢測其6種生物堿含量。結(jié)果見圖2。

不同英文字母表示含量存在顯著性差異，P<0.05圖2 黑順片炮制過程中不同酯型生物堿含量

由圖2可知：3種雙酯型生物堿總含量以生附子(對照組)為最高，并在炮制過程中逐步降低；3種單酯型生物堿總含量以黑順片為最高。泥附子浸膽7 d后雙酯型生物堿總含量降低至對照組的0.91倍，而單酯型生物堿總含量降低至對照組的0.22倍。煮制過后，雙酯型生物堿總含量降低至對照組的0.35倍，而單酯型生物堿總含量降低至對照組的0.13倍。漂片過程導致生物堿含量降低，且單酯型生物堿總含量達整個黑順片炮制過程中最低值，降低至對照組的0.05倍，雙酯型生物堿總含量降低至對照組的0.26倍。蒸制步驟可使雙酯型生物堿總含量降低至上一步驟的0.15倍，單酯型生物堿總含量增加至上一步驟的21.32倍。按最優(yōu)工藝炮制的黑順片中3種雙酯型生物堿總含量分別降低至對照組的0.04倍，而3種單酯型生物堿的總含量升高至對照組的1.23倍。驗證結(jié)果與正交試驗擬合結(jié)果基本一致，黑順片的雙酯型生物堿總含量范圍為0.002 9%～0.014 6%，單酯型生物堿的總含量范圍為0.030 4%～0.039 4%，均符合2020版《中華人民共和國藥典》關(guān)于黑順片的生物堿指標限定的要求。

2.4 總灰分、酸不溶性灰分測定

對正交試驗及其炮制環(huán)節(jié)中總灰分、酸不溶性灰分測定結(jié)果，如表5所示。

表5 炮制樣品的灰分測定結(jié)果 n=3

從表5可知：生附子中總灰分、酸不溶性灰分最低，膽附子的總灰分最高，說明浸膽會引起鹽分的高殘留，導致其總灰分、酸不溶性灰分值增大，而煮制、漂片工藝可以明顯減少鹽分殘留，從而降低總灰分、酸不溶性灰分。2020版《中華人民共和國藥典》關(guān)于附子灰分指標的限定為總灰分不超過6%、酸不溶性灰分不超過1%，而以本文中優(yōu)化工藝加工的黑順片的總灰分均低于5%，酸不溶性灰分均低于1%，符合最新版藥典要求。

3 討論

現(xiàn)代研究表明附子生品毒性大，所含酯型生物堿既為有效成分，又為毒性成分[13-14]，其中雙酯型生物堿是附子的主要毒性成分，但同時也具有強心、抗炎鎮(zhèn)痛等作用。雙酯型生物堿理化性質(zhì)不穩(wěn)定，在濕熱的條件下容易發(fā)生水解，一部分轉(zhuǎn)化成單酯型生物堿，另一部分轉(zhuǎn)化成出醇胺型生物堿或者經(jīng)過酯交換轉(zhuǎn)化成難溶于水的酯型生物堿[15]。炮制是附子減毒增效的重要傳統(tǒng)措施，然而炮制過度，則令有效成分嚴重損失，直接影響藥效。酯型生物堿類成分是藥典規(guī)定的評價附子飲片質(zhì)量是否合格的關(guān)鍵指標。本研究以“減毒增效”為目標，通過正交試驗研究了浸膽時間、煮制時間、漂片次數(shù)及蒸制時間4個工藝參數(shù)對黑順片炮制效果的影響，采用正交試驗及隸屬度法評價優(yōu)化了黑順片炮制工藝，最優(yōu)工藝可實現(xiàn)黑順片的3種單酯型生物堿總含量提高到生附片的1.42～1.83倍，3種雙酯型生物堿總含量降低至生附片的0.01～0.05倍，灰分指標亦符合2020年版《中華人民共和國藥典》要求，表明該工藝不僅降低了附子毒性，同時又保留了適量毒性成分兼藥效成分的雙酯類生物堿，并有效控制了膽鹽殘留。

目前關(guān)于黑順片傳統(tǒng)炮制工藝爭議最大的問題就是膽巴的使用問題。浸膽是附子傳統(tǒng)炮制工藝的最初處理工序，具有防腐作用，同時降低了生物堿含量，然而膽巴對胃有腐蝕性，若附子飲片膽鹽殘留超標不僅會影響飲片質(zhì)量，還會引發(fā)附子的不良副作用[16-18]。楊千千等[19]提出使用20%濃度以上的膽巴浸泡泥附子，其質(zhì)量相對穩(wěn)定；周林等[16]指出泥附子經(jīng)過浸膽9 d即可達到防腐的目的，且隨著浸泡時間的增長，單酯型生物堿和雙酯型生物堿含量會下降70%以上，這與本試驗中關(guān)于浸膽時間的結(jié)果基本一致。適當?shù)目s短浸膽時間，就可以達到防腐和減毒的效果。汪云偉[20]提出黑順片“味”的變化與炮制中膽巴的引入有關(guān)，這也是影響黑順片感官評價的重要依據(jù)。劉雨詩等[21]對比了有膽附片和無膽附片的生物堿成分，二者均可降低毒性成分，但有膽炮制存在炮制過度之嫌，認為無膽炮制工藝不引入無機雜質(zhì)，具有推廣和應(yīng)用價值。

近年來隨著技術(shù)發(fā)展，附子炮制出現(xiàn)一些現(xiàn)代炮制方法，如王昌利等[22]將生附片加兩倍量水浸泡24 h至全部泡透后置于鍋內(nèi)蒸10 h，晾干即得。該法總酯型生物堿含量較高，酯型生物堿含量較低，操作較方便，但耗時較長。方莉等[23]將生附片經(jīng)過潤濕處理后，0.10 MPa壓力下蒸制150 min，干燥即得。此法工藝簡便、需要設(shè)備較簡單、易操作、具有一定的生產(chǎn)指導意義，但該炮制工藝改動較大，仍需對其高溫炮制的作用機制、毒理學和藥理學展開研究；楊昌林等[24]進行了濕熱蒸制和干熱烘制的探究，其中濕熱蒸制法將生附片加水浸透后，于120 ℃的溫度下蒸制20 min，獲得蒸附片，而干熱烘制法將生附片于150 ℃于電熱恒溫鼓風干燥箱內(nèi)烘40 min，即得烘附片。兩種方法均能有效去除毒性成分，并保留有效成分，為附子炮制提供了新路徑。這些新的炮制方法，均印證了蒸制這一環(huán)節(jié)在附子炮制中的關(guān)鍵作用。

2020年版《中華人民共和國藥典》雖然新增了灰分檢測指標，但在具體飲片炮制工藝步驟上仍未進行統(tǒng)一規(guī)范。藥典收載的黑順片炮制方法由清代流傳至今，經(jīng)受住了時間的檢驗。雖然現(xiàn)代炮制方法多樣，但仍需要經(jīng)過一系列的藥理、臨床測試。因此，遵循“守正創(chuàng)新”中醫(yī)藥發(fā)展指導原則在飲片傳統(tǒng)炮制工藝的基礎(chǔ)上進行工藝優(yōu)化是相對適用的。